海洋生物毒素的分類、毒害作用機制及檢測技術研究進展

陳巧莉，楊 兵，洪晴悅，魏鱘鈺，方楚楚，闞建全

（西南大學食品科學學院，農業農村部農產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室（重慶），中國匈牙利食品科學合作研究中心，重慶 400715）

海洋生物毒素是目前關注度頗高的一類有害物質，其可在貝類、魚類等海洋生物體內積累，再通過食物鏈進入人體，當毒素攝入量累積到一定量時，極易引起人體中毒。據了解，每年全球約有6 000多起中毒事件與貝類毒素有關，致死率達1.5%[1]。其中由麻痹性貝類毒素（paralytic shellfish poison，PSP）引起的中毒事件比率占到87%，該毒素是全球分布最廣、事故發生率最高、危害程度最大的一類毒素；其次是腹瀉性貝類毒素（diarrhetic shellfish poison，DSP），約占5%[2-3]。中國食品科技網（http://www.tech-food.com/news/series/1300/）的報道顯示，每年夏秋季，在我國沿海城市發生的食物中毒事件中，有40%是由DSP引起的。2008年，由大連出口日本的油炸牡蠣被檢出DSP達到0.1 MU/g[4]；2011年5月寧波市爆發了由DSP引起的“淡菜”中毒事件，導致上百人中毒[5]；2017年6月，福建漳州164 人由于食入被PSP污染的貽貝、牡蠣等貝類導致食物中毒，出現頭暈、嘔吐、四肢癱瘓等癥狀[6]。近年來，全球由海洋毒素引起的食物中毒事件數量仍在逐年增加，僅美國每年就有7 600萬 人發生海洋生物毒素中毒，其中5 000 人死亡[7]。海洋生物毒素對于人類的影響不只是短期內的急性中毒，其在體內長期積累還會引發腫瘤和癌癥，對人類健康造成了潛在危害。因此，深入了解海洋生物毒素的分類、毒害作用機制以及相應的檢測技術，對人類的生命安全具有重要意義。

1 海洋生物毒素的概述

海洋生物毒素是一類存在于海洋生物體內的小分子化合物，大多由藻類、浮游植物或微生物產生，主要有以下特點[8]：1）化學結構獨特且多樣：結構類型異于其他毒素，部分結構為自身特有；2）生物活性高：可高度選擇并親和受體分子；3）毒性強：一般有劇毒，極易引起人類中毒；4）作用機理特殊：主要通過特異性作用于神經受體或離子通道，調控相關細胞活動產生作用。目前已發現1 000余種海洋生物毒素，已知結構的約有幾十種，其可在魚類、貝類等濾食性海洋生物體內累積且不對此生物體產生毒害作用，同時由于毒素熱穩定性好，不能被加熱或常規烹飪方式所破壞，因此其經過食物鏈被人類食用后極易引起人類中毒，嚴重時可致死，相關毒素傳遞過程見圖1。海洋生物毒素來源多、分布廣，根據不同的分類標準，可被分為不同種類，具體分類及部分典型海洋生物毒素的化學結構式分別見表1、2。

圖 1 海洋生物毒素傳遞過程Fig. 1 Transfer of marine biotoxins through the food chain

表 1 主要海洋生物毒素的分類Table 1 Classification of major marine biotoxins

表 2 部分典型海洋生物毒素的化學結構式Table 2 Chemical structures of typical marine biotoxins

續表2

2 海洋生物毒素的毒害作用機制

海洋生物毒素主要通過特異性作用于靶受體，改變相關離子通道功能，阻礙其電信號傳遞，紊亂生物體的生理功能，從而產生毒理作用。離子通道本質是親水性蛋白質微孔道，其作為細胞和外界環境進行信息傳遞的媒介，對維持正常生命活動起著重要作用。其中海洋生物毒素的作用離子通道主要有兩種[11]：一是電壓門控離子通道（如Na+、K+、Ca2+通道）；二是配體門控離子通道（如乙酰膽堿受體通道和谷氨酸受體通道），其靶標示意圖見圖2。

圖 2 海洋生物毒素主要靶標示意圖Fig. 2 Schematic diagram of the major targets of marine biotoxins

圖 3 海洋生物毒素的Na＋通道結構和結合位點Fig. 3 Sodium channel architecture and binding sites of marine biotoxins

表 3 幾種重要海洋生物毒素的毒害作用機制Table 3 Toxic mechanisms of several important marine biotoxins

對于大部分海洋生物毒素而言，其主要通過VDSC產生毒害作用。該離子通道由α、β1和β2 3 個亞基組成，α與β1非共價結合，α與β2共價結合[10]。由圖3可知，α亞基包括4 個同源域（I～IV），每個同源域包含6 個跨膜片段（S1～S6）和一個連接內外部的多肽環[9]，其中帶正電的S4段和連接同源域III和IV的親水性片段可分別激活和抑制VDSC。同時在VDSC上至少存在6 個不同的毒素靶受體結合位點，不同毒素與不同位點作用時，會產生不同的毒害作用，主要包括鈉通道阻滯劑、鈉通道激活劑和鈉通道抑制劑[20]。

其中鈉通道阻滯劑是一類與Na+通道位點1特異性結合的毒素，主要包括PSP和TTX等。PSP通常與神經細胞膜結合，造成細胞膜電壓門控的Na+通道高親和力障礙，影響或阻止Na+內流，從而使正常的動作電位無法形成，特異性干擾神經肌肉傳導過程，使隨意肌松弛麻痹，進而導致一系列中毒癥狀[21]。Sapse等[22]研究表明，Na+通道被STX抑制的原因是通道外膜胍基和羧基相互作用而不能結合Na+。此外，STX除了作用于Na+通道外，也能結合Ca2+、K+通道，是一種多受體靶位的海洋生物毒素。TTX的作用機制與PSP相似，為細胞膜Na+通道的選擇性快速阻斷劑，其活性基團是1、2、3位的胍胺基和C4、C9、C10位的羥基[23]，受體位于可興奮細胞膜外側、Na+通道外口附近，TTX與鈉通道受體部位1結合后，阻止Na+接近通道的外口，使Na+不能通過通道進入細胞內。NSP則是通過作用于Na+通道位點5而產生毒害作用，它與PSP阻斷Na+內流相反，NSP的活性成分PbTX可以誘導Na+內流，從而導致肌肉和神經細胞去極化，但其效果能被作用于Na+通道位點1的毒素（如STX和TTX）完全消除。對于鈉通道失活劑，主要是作用于Na+通道位點6的δ-CNTX。CNTX一般由10～31 個氨基酸殘基組成，含有2 對或3 對二硫鍵，目前已鑒定出了50多種CNTX。根據其作用受體的不同，將其分為δ-CNTX、μ-CNTX、α-CNTX以及ω-CNTX等多種類型，其中δ-CNTX特異性作用于神經元電壓依賴性Na+通道，延緩Na+失活，延長動作電位持續時間；而μ-CNTX的作用機制與PSP和TTX相似，能與Na+通道位點1特異性結合，阻斷Na+內流，抑制動作電位的產生；α-CNTX特異性阻斷突觸后膜乙酰膽堿受體；ω-CNTX特異性阻斷神經元電壓敏感性鈣離子通道，從而產生作用[24]。幾種重要海洋生物毒素的相關特性見表3、4。

表 4 不同類別CNTX的毒害作用機制Table 4 Toxic mechanisms of different conotoxins

3 海洋生物毒素檢測技術

3.1 生物分析法

3.1.1 小鼠生物分析法

小鼠生物分析（mouse bioassay，MBA）法是檢測海洋生物毒素毒性大小的常見技術之一。采用MBA法分析DSP時，樣品提取步驟繁瑣且提取液易受其他基質干擾，導致檢測誤差較大。故為更好地完善MBA法在DSP檢測上的應用，Lee等[32]將提取溶劑丙酮換成二乙基醚，消除了PSP干擾，但該法易損失低極性的DSP；而后改用添加己烷沖洗脂防酸的方法提取，檢測靈敏度提高，OA檢出限為0.8 μg/g。當加拿大首次爆發ASP中毒事件后，MBA法開始被用于檢測ASP。向小鼠腹腔注射DA后，其出現身體失衡、走動蹣跚及痙攣等癥狀，檢出限為40 μg/g；其中當毒素含量較高時（＞100 μg/g），中毒癥狀與劑量之間有良好的相關性。

3.1.2 其他生物體分析法

生物分析法的檢測對象除了小鼠外，還可選取家蠅、蝗蟲、水蚤等生物進行毒素檢測。采用家蠅生物分析法檢測PSP，主要是將PSP的酸性提取液注入家蠅體內，然后觀察記錄家蠅的活動特征和死亡時間。該法與MBA法十分相似，用其檢測貝樣中STX，檢出限為0.2 μg/g[33]。Hess等[34]采用水蚤生物分析法檢測OA和DTX，檢出限僅約為MBA法的1/10。在CFP的生物測試中，研究人員嘗試采用多種生物進行測試，其中受試動物主要有小雞、貓、鹵蟲、蚊子和雙翅目幼蟲等，其中小雞、貓、雙翅目幼蟲用有毒魚肉直接喂養，鹵蟲利用毒素提取溶液培養，蚊子采用毒素提取溶液注射，最后通過觀察受試動物中毒情況來判斷毒性，但這些方法均存在倫理道德問題的困擾且受自身弊端所限，無法推廣使用。

3.1.3 細胞毒性分析法

細胞毒性分析法也稱組織培養分析法，其毒性分析途徑主要有3 個：1）采用顯微觀察受試細胞（如神經母細胞瘤細胞、鼠干細胞等）的形態變化[35-36]；2）四甲基偶氮唑鹽顯色反應[37]；3）采用熒光比色法測定F-actin蛋白的表達水平[38]。采用細胞毒性分析法檢測PSP時，其原理基于箭毒和藜蘆定對神經母細胞瘤細胞Na+通道具有協同開放作用，可促進Na+內流，改變細胞內外滲透壓，最終使細胞形態腫脹甚至裂解死亡[39]；而PSP作為Na+通道阻斷劑對這種細胞腫脹起拮抗作用，且拮抗程度與毒素的劑量密切相關。Yamamori等[40]應用該原理，以小鼠神經細胞作為受試細胞，對PSP的關鍵組分STX進行細胞毒性測定。結果表明，STX檢出限為0.4 μg/g，同時該團隊采用神經細胞生物分析裝置分析貝類中STX，檢出限為0.02 μg/g，靈敏度遠高于MBA法。

3.1.4 免疫分析法

Garthwaite等[41]建立一個可對PSP、DSP、ASP和NSP進行分析的酶聯免疫分析（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）篩選系統，其靈敏度高，同時使用乙醇提取可得到較高回收率。Kawatsu等[42]開發了一種基于單克隆抗體的間接競爭ELISA檢測貝類中DA，檢出限為0.04 μg/g，加標平均回收率為103%；Wang Li等[43]對該法進行優化并用其檢測海鮮中的OA，檢出限為0.45 ng/mL，與高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）-熒光法結果的相關性為0.934 7，且有效避免了貝類基質的干擾。Zhou Yu等[44]基于單克隆抗體的膠體金免疫色譜條法檢測河豚魚組織中TTX，檢出限為40 ng/mL。Liu Binghui等[45]采取同樣的方法檢測OA，10 min內即可完成檢測，檢出限為5 ng/mL；同時該作者結合ELISA分別對20 個海鮮樣品中OA進行檢測，兩種方法數據吻合度高，具有較高的靈敏度和準確性，可用于快速篩查貝類樣品中OA。隨著技術發展及檢測需要，大量簡便快捷的商業化試劑盒應運而生。Harrison等[46]采用4 種商業化試劑盒（1 種ELISA試劑盒、1 種蛋白磷酸酶（protein phosphatase 2A，PP2A）試劑盒及2 種側流免疫測定試劑盒）檢測貝類DSP。研究表明，4 種試劑盒的檢測結果與HPLC所測結果都具有較好的相關性，除PP2A試劑盒外，另外3 種試劑盒結果均存在假陰性。

3.1.5 磷酸酶抑制法

磷酸酶抑制法操作時需選擇一種合適的物質（經酶催化后可在特定吸光度下發生顯色反應）作為反應底物，最早且最常使用的底物為硝基苯磷酸鹽（p-nitrophenyl phosphate，p-NPP），當待檢毒素中含有衍生物時，結果易產生假陰性。Ramstad等[47]優化熒光檢測法，將衍生物進行轉換，假陰性概率降低，準確度和靈敏度提高，同時該學者也發現絲氨酸-蘇氨酸PP2A溶液性質不穩定，最好現配現用。為防止酶溶液活性降低，學者們利用包埋法和金屬配位化學法將PP2A與磁性顆粒（magnetic particles，MPs）結合，以提高酶溶液穩定性[48]。2018年，陳佳琦等[49]采用溶膠-凝膠（Sol-gel）技術對PP2A進行包埋并將其固定于微孔板底部，建立新的貝類毒素檢測法（圖4）。采用該法檢測OA，檢出限為0.05 μg/g，加標回收率為68.8%～119.4%。通過包埋處理一方面保證了PP2A活性（可于-18 ℃下至少保存4 個月）；另一方面簡化了試劑配制步驟，省時高效。不同生物分析法在海洋生物毒素檢測應用上的比較，簡單歸納如表5所示。

圖 4 基于Sol-gel包埋的PP2A抑制比色法原理圖[49]Fig. 4 Principle of the colorimetric assay of protein phosphatase 2A inhibition based on immobilization in sol-gel[49]

表 5 生物分析法在海洋生物毒素檢測中的應用Table 5 Application of bioassays in the detection of marine biotoxins

3.2 物理化學分析法

3.2.1 高效液相色譜法

HPLC法包括HPLC-紫外檢測法（HPLC-ultraviolet，HPLC-UV）、HPLC-熒光檢測法（HPLC-fluorescence detector，HPLC-FLD），HPLC-質譜檢測法（HPLC-mass spectrometry，HPLC-MS）等，其中在海洋生物毒素檢測上最早得以應用的是HPLC-UV。

1989年，Lawrence等[50]首次采用HPLC-UV檢測貽貝組織中的DA。該法采用體積分數50%甲醇溶液提取組織勻漿，并用強陰離子交換固相萃?。╯trong anion exchange-solid phase extraction，SAX-SPE）進行凈化，檢出限約為0.5 μg/g，但因粗提液純度較低且含有色氨酸，結果極易出現假陽性。Donovan等[51]研究提出，采用甲醇-水提取組織樣品后在可進行梯度洗脫和UV檢測的反相C18色譜柱上分離，DA檢出限降低到0.1 μg/g，回收率從89%提高到100%；該法減少了手動清潔樣品步驟且有效避免了色氨酸的干擾。后來，López-Rivera等[52]省略SAX-SPE純化步驟，通過控制流動相pH值實現從基質干擾物和色氨酸中分離出DA及其異構體，并對其進行等度色譜分離。當pH值為2.5時，DA平均提取率達98.5%，檢出限為25 ng/mL。此方法已成功檢測多種貝類毒素，操作簡單、耗時少且靈敏度高。

對于部分海洋生物毒素來說，其自身對紫外的吸收較弱且無法產生熒光，但在堿性條件下先氧化再酸化可產生熒光物質，對此常用HPLC柱后衍生法進行檢測分析。柱后熒光檢測常用的衍生物主要有9-蒽基重氮甲烷（9-anthryldiazomethane，ADAM）、1-芘重氮甲烷、1-溴代乙?；藕?-溴甲基-7-甲基香豆素等[53]。其中使用頻率最高的是ADAM，與其他試劑相比，其可在溫和條件下進行快速定量反應，具有較高的選擇性和靈敏度；但該試劑易分解，從而導致不完全衍生化并干擾分析，故其必須在低溫下保存。為提高試劑穩定性，Nogueiras等[54]對ADAM合成方法進行改進并在流動相中添加終體積分數為15%的甲醇溶液，采用優化后的HPLC-FLD對OA進行檢測，色譜分離度提高，檢出限由1.0 ng/g降低到0.714 ng/g；但由于該法洗脫耗時長、儀器設備昂貴且對技術人員專業要求高，故其應用受到一定限制。基于此，江天久等[55]將兩次等度洗脫合并為一次梯度洗脫，實現了一次進樣即可同時定性定量待測樣品中GTX和STX組分，極大縮短樣品分析時間，其中dcGTX3的最低檢出限為7 pg/g，GTX5的最高檢出限為52 pg/g。Vale[56]采用同樣的方法測定貽貝中OA及DTX-1，檢出限分別為0.8 pg/g和1.3 pg/g。

隨著質譜技術的高速發展，HPLC-MS逐漸成為毒素分析的一種主流技術。該技術克服傳統HPLC的缺點，允許在沒有毒素標品及衍生物的情況下，對毒素進行定性定量分析，具有靈敏度高、耗時短、檢出限低、重現性好等優點。Stobo等[57]利用HPLC-MS檢測OA、DTX-1、DTX-2、YTX、PTX-1、PTX-2、AZA-1、AZA-2和AZA-3。該法采用無水甲醇-水（80∶20，V/V）提取貝類中毒素，再利用C8反相柱對毒素進行梯度洗脫分離。結果顯示，OA、PTX-2和AZA-1的檢測范圍為0.013～0.250 μg/g，YTX的檢測范圍為0.1～0.4 μg/g。Bra?a-Magdalena等[58]優化樣品前處理條件，建立超高效液相色譜-MS/MS檢測方法。該法可在酸性條件下通過快速極性切換鑒定出14 種親脂性海洋毒素。在快速極性切換中，動態多反應監測優于靜態多反應監測，顯現出檢出限更低、重現性更好且樣品通量更大等優點；同時結合與基質匹配的標準品對貽貝提取液中毒素進行準確定量，分析時間少于3 d，其中DTX1、DTX2、YTX和AZA1的回收率均為80%～120%，相對標準偏差≤8%。de la Iglesia等[59]利用快速液相色譜-串聯四級桿質譜（rapid resolution liquid chromatography-mass spectrometry，RRLC-MS/MS）的方法快速分離貝類中ASP。該法可直接分析粗提物，無需進一步純化，整個過程不到3 min即可完全分離出DA及其異構體，檢出限為0.05 μg/g；與LC-UV檢測結果一致（R2＝0.975 1），可用于基質較復雜的毒素檢測。

3.2.2 薄層色譜法

薄層色譜法（thin-layer chromatography，TLC）是食品分析領域中廣泛使用的技術，過去常用其篩查農業產品中是否存在霉菌毒素[60]，如今，TLC逐步應用到海洋毒素的檢測分析中。Quilliam等[61]開發了一種結合SPE純化的TLC用于半定量分析貝類組織中DA，使用手持式短波紫外線燈檢測發現DA含量低至10 μg/g，同時采用茚三酮噴涂硅膠TLC板發現茚三酮與DA的仲胺反應生成鮮明的黃色產物。該TLC簡單快速，且不需要使用昂貴的設備，故適合未配備LC系統的實驗室進行貝類組織的常規篩查。Indrasena等[62]聯合火焰熱離子檢測器（flame thermionic detector，FTID）建立針對PSP檢測的TLC。結果顯示，FTID響應隨著檢測器電流和掃描時間的延長增加，當檢測器電流提高到3.3 A時，FTID響應比FID高出130 倍；采用該法檢測GTX 2/3、STX、neo-STX，其檢出限分別為0.4、2.1 μg/g和0.8 μg/g。

3.2.3 毛細管電泳法

毛細管電泳法（capillary electrophoresis，CE）常用檢測器有紫外檢測器、激光誘導熒光（laser induced fluorescence，LIF）檢測器和電化學檢測器，其中最早得以應用的是UV檢測器。Bouaicha等[63]首先用配有UV檢測器的膠束電動毛細管色譜法鑒定貽貝中OA與DTX-2，但因緩沖液選擇不佳，致使實驗結果不理想。Kinoshita等[64]優化傳統UV法后測定貝類中OA和DTX-1，兩者檢出限均為3.25 μg/mL，而后又通過控制緩沖液pH值，開發了準靜態掃描富集分析技術，實現增大進樣量的同時將STX和DA的檢測靈敏度分別提高了950 倍和810 倍。Gago-Martínez等[65]建立一種用于分析DA的毛細管電泳色譜法（capillary electrochromatography，CEC）。研究發現，電流流過色譜柱時由于產熱易出現氣泡，產生基線噪音，從而難以獲得穩定的流動相條件；此外，采用電動注射，樣品基質易受電導率影響，穩定性和可重復性低。為更好地完善CEC，Wu Weimin等[66]結合CEC的高效性和HPLC的高選擇性提出了加壓毛細管電泳色譜法（pressurized capillary electrochromatography，pCEC），其HPLC泵連接到毛細管的入口端，用溶劑向毛細管柱提供輔助壓力從而抑制氣泡形成，并采用螺旋式進樣器實現定量進樣。在最佳條件下，該法6 min即可分離出DA，檢出限為2 mg/g。因毛細管柱的光路長度較短，故其檢測靈敏度較低。為此，Cheng Yongqiang等[67]開發了一種低試劑消耗且穩定靈敏的pCEC-LIF技術，60 s內即可完全分離DA，檢出限可達15 ng/g，靈敏度高于pCEC-UV且流動相消耗僅為常規HPLC的1/800。

3.2.4 拉曼光譜法

近年來，表面增強拉曼光譜（surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS）憑借高選擇性檢測樣品中目標分子而備受關注。Yao Yiping等[68]通過紫外共振拉曼法檢測DA，當激發波長為242 nm和257 nm時，其檢出限分別為1 μg/mL和2.5 μg/mL。研究表明，基于Ag納米粒子的膠體水溶膠對STX進行SERS快速檢測，5 s即可完成40 ng/mL STX樣品的光譜收集，其檢出限為3 ng/mL；同時該作者采用1 min的總積分時間（每次10 s，6 次累積）收集SERS光譜以提高信噪比，減少了樣品處理和底物制備工作。基于此，Müller等[69]分別以純Ag納米粒子和氨基化的Ag納米粒子為基質，以蒸餾水和海水為溶劑，對貝類中DA進行SERS檢測。結果顯示，采用氨基化的Ag納米粒子效果優于未氨基化的Ag納米粒子，采用海水溶解的檢出限低于蒸餾水溶解的檢出限，分別為0.033 ng/mL和0.33 ng/mL。為進一步縮短檢測時間，Huai Qiyong等[70]采用SERS結合激光鑷子拉曼光譜檢測STX，該法2 s內即可獲得拉曼光譜峰，檢出限為2 ng/mL。Traynor等[71]應用滴涂沉積拉曼技術檢測低濃度樣品中的DA，其拉曼光譜信號清晰且無噪音，檢出限為25 ng/mL。

物理化學法主要依賴于色譜分離技術和紫外、熒光、質譜定性定量技術，其在海洋生物毒素檢測方面的應用簡單歸納如表6所示。

表 6 物理化學法在海洋生物毒素檢測中的應用Table 6 Applications of physicochemical methods in the detection of marine biotoxins

3.3 電化學生物傳感器法

3.3.1 免疫傳感器

免疫傳感器的設計關鍵是表面免疫固定技術的選擇。在多數情況下，牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）或卵清蛋白常被用作毒素固定在電極表面上的載體。Campàs等[72]將競爭ELISA與酶標記進行結合，開發用于檢測貝類中OA（圖5）。該法將堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）和辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）作為標記物進行信號追蹤，采用計時電流法對OA進行檢測，其檢出限分別為1.07 ng/mL和1.98 ng/mL；為進一步提高其靈敏度，該作者采用心肌黃酶優化ALP標記，檢出限降低至0.03 ng/mL。與MBA法相比，該法不僅分析時間短、檢出限低，而且有效避免了YTXs的干擾，防止出現假陽性。對于低分子質量毒素（如PbTX等），通常只有一個羥基可用于交聯，這阻礙了其在免疫傳感器上的固定化。Micheli等[73]對首次開發的PbTX電化學免疫傳感器進行改造，獲得PbTX-BSA結合物，并將該結合物固定在絲網印刷電極（screen-printed carbon electrode，SPCE）表面進行競爭性分析，檢出限為6 ng/mL。Hayat等[74]研究發現，在電極表面涂覆蛋白質載體會降低傳感器靈敏度及電子傳遞速度。因此，該團隊研究建立了兩種毒素固定方法（基于重氮偶聯反應機理在SPCE表面直接固定OA；采用鏈霉親和素包被免疫磁珠（immunomagnetic beads，IMBs）固定OA）。結果顯示，前者檢出限為1.44 pg/mL，低于歐盟指定的檢出限（2.4 ng/mL）[72]；后者檢出限為0.38 ng/mL，毒素回收率為96%，且不受基質效應的干擾。另外，研究人員用樹狀大分子固定PbTX-2，同時結合金納米粒子（gold nanoparticles，AuNPs）進行檢測。結果表明，三維網絡的應用大大提高免疫固定化率，此外，利用AuNPs提高了傳感器靈敏度，檢出限為0.01 ng/mL，遠低于僅含AuNPs或樹狀大分子的免疫傳感器（分別為0.5 ng/mL和0.1 ng/mL）[75]。研究表明，利用多壁碳納米管（multi-walled carbon nanotube，MWCNT）修飾電極，可減少非特異性吸附，降低基質效應，提高該傳感器的適用性。2015年，Reverté等[76]開發了結合AuNPs和聚乙烯的電化學生物傳感器用于檢測河豚中TTX，檢出限為0.07 μg/g，低于免疫比色法（檢出限0.23 μg/g），同時基質效應降低。隨后Leonardo等[77]將IMBs與八電極陣列相結合，實現了AZAs的多重電化學檢測，檢出限比免疫比色分析降低了2.6 ng/mL。

圖 5 基于競爭性間接檢測OA的電化學免疫傳感器[78]Fig. 5 Electrochemical immunosensor for okadaicacid detection based on a competitive indirect assay[78]

3.3.2 酶傳感器

迄今為止，只有PP2A和磷酸二酯酶已被確定為特定的海洋毒素生物識別分子，其中DSP和MC、YTX可對其活性產生抑制作用。采用酶傳感器法檢測DSP的主要挑戰是聚丙烯的不穩定性及樣品基質對酶活性的影響。目前，為提高酶穩定性，通常將酶包埋后再把聚丙烯固定在微量板上對毒素進行檢測，同時使用固相萃取分離樣品以降低基質效應。2007年，Campàs等[78]首次將聚丙烯固定在SPCE上，采用單磷酸淀粉測定酶活性，開發相應的酶傳感器。采用該傳感器對OA進行檢測，其檢出限為6.42 ng/mL；同時對甲藻提取物進行分析，結果與HPLC-MS法測定的結果吻合度高。這種固定方法雖然保證了酶穩定性，但同時酶與底物、毒素之間的特異性識別受限。為克服這種弊端，可采用氨基酸殘基與金屬親和作用進行固定化，將酶固定在Ni改性的IMBs上。Gu Huajie等[79]開發了將MWCNT膜結合到電極表面的生物傳感器，由于MWCNT側壁與酶上芳香環之間的氫鍵和π-π堆積作用，故酶的固定化過程是穩定的。采用該法檢測貝類中OA，檢出限為2.75 μg/g。Ikehara等[80]基于MC對PP2A的抑制作用，研發了用于檢測MC的安培生物傳感器。該法將經包埋后的PP2A固定在經石墨烯修飾的SPCE上，以單磷酸兒茶酚基酯、磷酸α-萘基磷酸酯及4-甲基傘形基磷酸酯作為磷酸化底物，通過電化學方法檢測PP2A活性，從而判斷毒素活性。采用該法對水華樣品MC進行分析，當35%和100% PP2A被抑制時，其檢出限分別為0.037 μg/mL和1 μg/mL。Smienk等[81]將OA的蛋白磷酸酶抑制與丙酮酸氧化酶的磷酸鹽離子消耗相結合進行檢測，檢出限為0.1 ng/mL，僅約為比色免疫法的1/50。

3.3.3 適配體傳感器

適配體傳感器中的適配體作為特異性識別受體，具有以下特點：1）選擇過程在體外，避免了動物實驗且成本低；2）高度穩定，可長期儲存；3）極易被功能基團修飾。Eissa等[82]研制無標記阻抗傳感器檢測OA。該法將適配體固定在金電極上，通過與毒素結合的適配體構象改變而引起的阻抗信號變化來監測海洋毒素，其檢出限為70 pg/mL；在貝類樣品分析中，毒素回收率達92%。2015年，Eissa等[83]首次從大量體外隨機序列中成功篩選出對PbTX-2具有高親和力的DNA適配體，對加標貝類提取物中的PbTX-2進行檢測，檢出限為106 pg/mL，回收率達110%，且未發現與其他海洋毒素的交叉反應，該法將有助于食品樣品中PbTX-2的常規檢測。為準確檢測較低濃度的PTX，Gao Shunxiang等[84]結合生物層干涉法引入基于HRP適配體的信號增強技術，10 min即可實現對海鮮中PTX的實時檢測，檢出限為0.04 pg/mL；該傳感器重現性高、穩定性好且可特異性區分PTX與其他海洋生物毒素。

3.3.4 細胞傳感器

STX、TTX和PSP均可通過抑制流經Na+通道的離子電流而干擾Na+通道功能?；诖?，Wang Qin等[85]利用心肌細胞建立阻抗生物傳感器檢測STX和TTX，該生物傳感器可同時監視心肌細胞的生長和跳動狀態，對STX和TTX的檢出限分別為0.087 ng/mL和0.089 ng/mL。同年，該作者聯合心肌細胞和微電極陣列快速檢測STX和PbTX-2。結果顯示，5 min即可完成檢測，STX和PbTX-2的檢出限分別為0.35 ng/mL和1.55 ng/mL。Zou Ling等[86]利用神經母細胞瘤細胞設計了阻抗生物傳感器（cell impedance biosensor，CIB）檢測PSP。研究表明，該傳感器靈敏度和特異性高，檢出限低至0.03 ng/mL，低于MBA法檢出限（200 ng/mL）和分析化學家協會HPLC官方方法檢出限（1.2 ng/mL）。此外，該作者還基于人類HeLa和HepG2細胞系分別建立CIB，以動態、實時的方式檢測DSP，其檢出限分別為10.2 μg/L和3.3 μg/L，均低于傳統的細胞測定法（HeLa細胞：21.2 μg/L；HepG2細胞：9.8 μg/L），且與MBA、LCMS/MS法的測定結果之間具有良好的相關性[87]。

電化學生物傳感器主要是利用特定生物分子與海洋毒素間的高親和力，通過信號轉化實現海洋毒素的高靈敏檢測。由于相關設備的微型化、便攜化和自動化，使得生物傳感器在現場檢測和在線監控方面具有很好的應用前景，其在海洋生物毒素檢測上的應用，簡單歸納如表7所示。

表 7 電化學生物傳感器在海洋生物毒素檢測中的應用Table 7 Applications of electrochemical biosensors in the detection of marine biotoxins

4 結 語

作為海洋生物生產的天然活性產物，海洋生物毒素是自然界已知化合物中結構最復雜、毒性差別最大的種類之一。隨著因赤潮引發的海產品毒素污染問題日益嚴重及各類食物中毒事件的頻繁發生，人們更加意識到海洋生物毒素的潛在危害，該類毒素毒性強、致死量低，對人民健康及社會公共安全構成了極大威脅。因此，深入了解海洋生物毒素并及時監測對保障人民健康尤為重要。

目前，海洋生物毒素作用機理方面的研究雖然取得了突破性進展，但仍有一些毒素的作用機理尚不清楚，且尚無切實可行的方法去除海產品體內的毒素以防止其進入人體，所以深入學習海洋生物毒素的結構特點，強化研究其毒害作用機制，從而對海洋生物毒素進行風險評估是必需的。同時在海洋生物毒素檢測上，一方面應簡化樣品前處理方式，提高待測樣品及試液純度，并開發特異性強的基因芯片和生物傳感器，提高檢測專一性與靈敏度；另一方面應加大商業化試劑盒、便攜式檢測工具及自動化檢測儀器的開發，簡化操作步驟，實現檢測技術日常化。此外，為了保護消費者健康，適當的風險評估和海產品的監管控制極為重要，為此，我國應加強相關法律法規建設，健全市場監察制度，以更好地保障消費者的食品安全。