基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的僵蠶主要藥效作用研究?

權(quán)浩浩，張曉鳳，高 凱，杜 霞

1 陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽712046；2 陜西省中醫(yī)醫(yī)院；3 陜西省中醫(yī)藥研究院

僵蠶，亦稱白僵蠶、天蟲、僵蟲、白僵蟲，首見于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為蠶蛾科昆蟲家蠶（Bombyx moriL）4～5 齡的幼蟲感染（或人工接種）白僵菌［Beauveria bassiana（Bas.）Vuillant］而致死的干燥體，多于春、秋季產(chǎn)生［1］。性味咸、辛、平，具有祛風(fēng)定驚、化痰散結(jié)的功效。僵蠶單獨使用或與其他中藥配伍廣泛應(yīng)用于中醫(yī)臨床，涉及內(nèi)、外、婦、兒各科，主治驚風(fēng)抽搐、咽喉腫痛、皮膚瘙癢、頜下淋巴結(jié)炎、面神經(jīng)麻痹等。僵蠶的主要化學(xué)成分為蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、黃酮、有機酸和衍生物、甾體、微量元素等，主要具有抗凝血、抗驚厥、抗腫瘤、降低血糖等藥理活性［2］，但具體作用機制尚不清楚。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是在高通量組學(xué)數(shù)據(jù)分析、計算機模擬計算及網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫檢索的基礎(chǔ)上，進行生物網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析，進而進行藥物作用機制的研究及創(chuàng)新藥物的發(fā)現(xiàn)。該方法從藥物、靶點與疾病間相互作用的整體性和系統(tǒng)性出發(fā)，采用復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)模型表達和分析研究對象的藥理學(xué)性質(zhì)，特別適宜研究中藥多成分、多靶點的作用關(guān)系，有利于揭示中藥復(fù)雜作用機制［3-7］。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，利用靶標識別、京都基因及基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析及網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建等對僵蠶的藥效成分及主要藥理作用進行探究，為該藥及其方劑的研究和臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 化學(xué)成分收集采用化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫（http：//www.organchem.csdb.cn/scdb/default.htm）及文獻挖掘等方式，對僵蠶成分進行收集，并結(jié)合文獻信息做適當(dāng)增補刪減，建立僵蠶化學(xué)成分數(shù)據(jù)庫。

1.2 靶標識別及疾病關(guān)聯(lián)通過PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫查找、下載所有化合物結(jié)構(gòu)，利用中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺（TCMSP）（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）、Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/）作用靶點預(yù)測模型預(yù)測上述成分的作用靶點。其中利用化合物結(jié)構(gòu)在Swiss Target Prediction 預(yù)測的靶點，依據(jù)可能性由大到小，選取前15 個靶點，利用TCMSP預(yù)測的靶點全部保留。由Uniprot（http：//www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫檢索獲取所有靶標的基因信息，將靶標名稱轉(zhuǎn)化為標準的基因名稱，然后通過查找TTD、DisGeNET 等生物信息庫，同時結(jié)合僵蠶現(xiàn)代藥理作用研究將靶標映射在相關(guān)疾病中，進而得到相關(guān)疾病的靶標。

1.3 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及分析基于上述所獲得的藥材、僵蠶成分、靶點信息、疾病關(guān)聯(lián)等數(shù)據(jù)，采用Cytoscape3.2.1 進行“藥材-成分-靶標-疾病”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，并利用Cytoscape 中的插件network analyzer 分析網(wǎng)絡(luò)的拓撲性質(zhì)，如：度值、介數(shù)中心值和緊密中心值等。

1.4 KEGG 通路富集分析利用DAVID 數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）對所有靶點進行KEGG通路富集分析，將富集出的結(jié)果根據(jù)P＜0.05并結(jié)合生物信息學(xué)，選取靶點較多的通路，以圖表形式呈現(xiàn)。

2 結(jié)果

2.1 化學(xué)成分收集共獲得僵蠶39 個化學(xué)成分，其中化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫中檢索到29 個，另外10個來源于文獻挖掘，分別為槲皮素、山萘酚、谷氨酸、丙氨酸、纈氨酸、甘露醇、赤蘚酸、尿嘧啶、β-谷甾醇、胡蘿卜苷［8］。

2.2 靶標識別與疾病關(guān)聯(lián)利用TCMSP、Swiss Target Prediction 靶點識別模型預(yù)測上述成分的作用靶點，39種成分共對應(yīng)939個靶點（去重后415 個）。通過查找TTD、DisGeNET 等生物信息庫將靶點映射于相應(yīng)疾病。根據(jù)文獻報道，僵蠶具有抗驚厥、抗癌、降低血糖、血脂等藥理作用，并通過抗炎、調(diào)整免疫治療支氣管哮喘、疼痛類疾病［8-9］。基于此，將糖尿病、哮喘、腫瘤、疼痛相關(guān)疾病等作為研究重點，最終確定了與以上4 類疾病相關(guān)的靶點共351個（去重后224個），其中與糖尿病相關(guān)82 個，哮喘相關(guān)47 個，疼痛類疾病65個，腫瘤相關(guān)157 個，所有靶點以其基因名作為標記。

2.3 藥材-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及分析采用Cytoscape 3.2.1 軟件構(gòu)建“藥材-化合物-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖，綠色圓形點代表僵蠶，藍色菱形點代表化合物，紫色三角形點代表靶標，紅色六邊形點代表疾病。該網(wǎng)絡(luò)共有459 個節(jié)點（其中，藥材1個，化合物39個，靶標415個，疾病4個），1330 條邊。利用network analyzer 插件分析網(wǎng)絡(luò)的度值、介數(shù)中心值和緊密中心值3 個拓撲學(xué)性質(zhì)參數(shù)，3 項值均高于平均值的化合物27個，靶標20個。Degree值排名前六的化合物分別是槲皮素、山奈酚、丙氨酸、天門冬氨酸、β-谷甾醇、谷氨酸。其中，槲皮素（degree=151）和山奈酚（degree=64）的度值遠遠高于其他化合物，屬黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、降低血糖、血脂等多種生物活性作用［10-11］。見表1、圖1。

表1 僵蠶的主要活性化合物信息

圖1 僵蠶-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)

相關(guān)研究表明：槲皮素可通過減輕大鼠外周胰島素抵抗、降低機體氧化應(yīng)激水平、增加骨骼肌細胞表面GLUT4 表達、增強肝臟丙酮酸激酶活性、抑制胰島細胞凋亡等諸多途徑發(fā)揮降低糖尿病大鼠血糖的作用［12-14］。史麗穎等［15］發(fā)現(xiàn)：槲皮素組大鼠血清白三烯（leukotriene，LT）和IgE含量、肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）和全血嗜酸性粒細胞（eosinophils，EOS）的數(shù)量及肺組織炎癥面積均較低，并推測槲皮素通過抑制炎性介質(zhì)釋放、降低炎性反應(yīng)而發(fā)揮抗速發(fā)型過敏反應(yīng)的作用。吳剛等［16］證明白僵菌素對支氣管哮喘模型小鼠的氣道炎癥有抑制作用，能減少炎癥因子的表達，可能促進炎癥細胞凋亡。有文獻［17］表明：槲皮素可通過抑制癌細胞增殖、增強藥物及放射敏感性、逆轉(zhuǎn)耐藥性、抑制癌細胞遷移和侵襲、誘導(dǎo)癌細胞自噬等機制發(fā)揮抗癌作用，在體外可對多種癌細胞產(chǎn)生抑制作用。程杏安等［18］證實僵蠶所含成分β-谷甾醇和棕櫚酸具有抗腫瘤活性作用，并呈現(xiàn)濃度依賴性。

槲皮素可能通過Wnt/β-catenin 通路抑制疼痛相關(guān)分子的表達，從而緩解神經(jīng)病理性疼痛［19］。活性氧（reactive oxygen species，ROS）可減少脊髓神經(jīng)元γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid,GABA）釋放，從而增強神經(jīng)性疼痛［20］，而槲皮素能清除過量的活性氧、從而減輕大鼠坐骨神經(jīng)慢性縮窄性損傷模型的機械痛敏和熱敏效應(yīng)［21］。本研究顯示20 個關(guān)鍵靶標Degree 值排名前六的靶標分別是PTGS2（degree=25）、OPRM1（degree=20）、CTSD（degree=18）、HDAC1（degree=16）、F2（degree=13）、PTGS1（degree=12），表示分別與25、20、18、16、13、12個化合物相連接。其中PTGS1和PTGS2 是前列腺素內(nèi)源性過氧化物合酶（prostaglandin G/H synthase，PTGS）的2 個異構(gòu)酶：結(jié)構(gòu)性（PTGS1、COX-1）和誘導(dǎo)性（PTGS2、COX-2），PTGS2 又稱為環(huán)氧化酶，是生成前列腺素的關(guān)鍵酶，屬即刻早期反應(yīng)基因，在靜息細胞及正常生理狀態(tài)下多數(shù)組織內(nèi)檢測不到其表達，但如炎性反應(yīng)、激素、腫瘤啟動子被高度誘導(dǎo)，從而催化花生四烯酸產(chǎn)生多種前列腺素類物質(zhì)，導(dǎo)致疼痛和炎癥反應(yīng)［22］。同時，PTGS 及其產(chǎn)物參與機體腫瘤新生、血壓調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)、凝血平衡等多種生理和病理過程［23］，涉及多種疾病。組織蛋白酶D（cathepsin D，CTSD），主要表達于血管內(nèi)皮細胞和纖維母細胞，是一種具有多種生物功能的蛋白水解酶，參與調(diào)解細胞的凋亡、細胞增殖、細胞基質(zhì)退化和血管的生成等［24］。凝血酶原F2 在維持血液穩(wěn)態(tài)、炎癥反應(yīng)及傷口愈合中均有重要的調(diào)節(jié)作用［25］。見表2。

2.4 KEGG 通路富集分析對糖尿病、哮喘、腫瘤、疼痛類疾病相關(guān)的靶點分別進行通路富集分析，初步結(jié)果顯示：與糖尿病相關(guān)的靶點共富集在60條通路上，與哮喘相關(guān)的靶點共富集在19條通路上，與腫瘤相關(guān)的靶點共富集在116 條通路上，與疼痛相關(guān)的靶點富集在20 條通路上。根據(jù)P＜0.05，并結(jié)合生物信息學(xué)，選取靶點數(shù)較多的前10條通路，以圖表的形式呈現(xiàn)。見圖2。

表2 僵蠶關(guān)鍵靶標信息

圖2 KEGG通路富集結(jié)果

圖2A 顯示：糖尿病相關(guān)的基因主要富集在代謝通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、PI3K-Akt信號通路等通路上，分別富集了18、14、9 個基因。其中代謝通路富集的靶點數(shù)目最多，分布了XDH、CYP3A4、GATM、PTGS2、GLUD1、PTGS1、ACACA、ADH1C、ADH1B、CYP1A2、GOT2、DGAT1、PYGM、MAT1A、GFPT1、MGAM、AKR1B1、HSD11B1 等18 個靶點。圖2B 顯示：哮喘相關(guān)的基因主要富集在神經(jīng)活性配體-受體相互作用、鈣信號通路、cAMP 信號通路等通路上，分別富集了15、9、7 個基因。其中OPRM1、PTGER3、PTGER4、TRPV1、TACR2、DRD2、GRIK2、TACR1、PRSS1、OXTR、GRM1、ADORA1、ADRB2、CHRM4、CHRM2 等15 個基因分布在神經(jīng)活性配體--受體相互作用通路上。圖2C 顯示：腫瘤相關(guān)的基因主要是富集在癌癥通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、PI3K-Akt信號通路等通路上，3 條通路分別富集了39、25、20 個基因。其中XIAP、PTGS2、BCL2、EGFR、AR、TP53、RAF1、BIRC5、PRKCB、MAPK1、JAK1、MAPK8 等39個基因富集在癌癥通路上。圖2D顯示：疼痛相關(guān)的基因主要富集在神經(jīng)活性配體-受體相互作用、鈣信號通路、cAMP 信號通路等通路上，分別有25、14、7 個基因富集在相關(guān)通路上。其中OPRM1、GABRA2、DRD1、GABRA1、PTGER3 等25 個基因富集在神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路上。細胞色素P450 酶（CYP3A4）在激素合成分解、膽固醇合成和維生素D 代謝方面扮演重要角色［26］。劉鑫馗等［27］運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法構(gòu)建四君子湯的作用靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)PTGS2 參與了包括阿爾茨海默癥、炎癥、痛癥、乳腺癌、前列腺癌等諸多疾病發(fā)生、發(fā)展過程。B 細胞淋巴瘤2 具有抑制凋亡和促進凋亡兩種截然相反的生物學(xué)效應(yīng)，其在調(diào)節(jié)細胞凋亡、腫瘤發(fā)生以及對抗癌細胞反應(yīng)等方面發(fā)揮重要作用［28］。表皮生長因子受體對腫瘤細胞生長、細胞增殖、血管生成、腫瘤細胞侵襲、轉(zhuǎn)移及細胞凋亡均有一定的調(diào)節(jié)作用［29］。

綜上所述，僵蠶可通過多成分、多靶點、多通路治療糖尿病、哮喘、腫瘤、疼痛類疾病。