刺山柑對佐劑型關節炎大鼠Th17/Treg 免疫失衡的影響?

霍新慧，徐海燕，樊思恩，赫吉銘，黨 歡

新疆醫科大學中醫學院，新疆 烏魯木齊830054

類風濕性關節炎（rheumatoid arthritis，RA）主要表現為進行性、慢性、對稱性多關節炎，RA 不僅直接導致關節疼痛、腫脹、功能下降，還可累及全身多個器官，嚴重影響人類健康和生活質量［1］。RA 的病因至今尚未明確，一致認為感染和自身免疫紊亂是其發生的關鍵因素［2］，在免疫機制方面主要與T細胞亞群數量和功能密切相關［3］。

刺山柑（Capparis Spinosa）又名槌果藤，野西瓜、老鼠瓜，新疆民間用該藥外敷治療RA 歷史悠久［4］。本實驗在建立佐劑型關節炎大鼠模型的基礎上通過檢測大鼠血清白細胞介素17(interleukin-17，IL-17)、IL-6、IL-10、IL-23及轉化生長因子β(tranforming growth factor-β，TGF-β)含量，探討新疆特色藥材刺山柑對類風濕性關節炎可能的免疫調節機制，為臨床應用刺山柑治療RA提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF 級Wistar 大鼠40 只，體質量（180±20）g，雌雄各半，購于新疆醫科大學動物中心，實驗動物合格證號：SYXK（新）2016-0002，動物標準住宿條件為溫度（22±2）℃，濕度55%～60%，明暗交替各12 h，自由飲食、攝水，屏障環境質量合格證：65000700000749。

1.2 主要藥物與試劑刺山柑（新疆新特藥有限公司，新疆醫科大學中醫學院中藥系藥物資源教研室鑒定）；甲氨蝶呤片（上海醫藥有限公司信誼制藥廠，批號：161003，規格2.5 mg/片）；完全弗氏佐劑（Sigma公司，批號：F5506）；IL-17、IL-6、IL-10、IL-23及TGF-βELISA檢測試劑盒（美國Bim公司，批號：B164775、5SNCCTLQCA、MJPMS5HZNT、JHNHCJX3UZ、3RULJ3FEUH）。

1.3 模型制備左后足跖底部皮膚常規消毒，拉直后肢，用1 mL注射器皮內注射完全弗氏佐劑（每只0.1 mL）。造模3 天后評定模型成功與否：無關節紅腫計0 分；足小趾關節紅腫計1 分；趾關節和足趾腫脹計2 分；踝關節以下均紅腫計3 分；包括踝關節在內的全部足爪的腫脹計4 分。關節炎指數（arthritis index，AI）即每只大鼠四肢評分分數之和。評分達到6分以上即為造模成功。

1.4 分組與干預大鼠適應性喂養3 天后稱重標記，采用隨機數字表法選取10 只為正常組，其余大鼠均進行造模，將造模成功的大鼠再次稱重后按照體質量分層原則隨機分為模型組、陽性藥組和刺山柑組，每組10 只。陽性藥組將甲氨蝶呤均勻混合于0.9%氯化鈉溶液，按照0.1 mg/100 g的劑量灌胃，每3 日1 次（每周2 次），共灌胃3 周。刺山柑組將刺山柑果實打粉粗提取，與45°白酒和蛋清（1∶2）混合均勻，適量外敷于大鼠左后足踝，紗布包裹并固定，敷藥每日1 h，連續敷藥6 天（1 個療程），間休1 天，共敷藥18 天（3 個療程）。敷藥過程中觀察大鼠，以防紗布脫落大鼠舔舐藥物。

1.5 觀察指標

1.5.1 一般情況每日觀察大鼠精神狀態、飲食攝水、活動度、毛發色澤和排便等一般情況。

1.5.2 AI 指數造模后3 天及每個療程后評價AI指數。

1.5.3 足爪容積造模和每個療程后采用排水法測量足爪容積。首先用標記筆在大鼠踝關節上方約l cm處畫圈做為標記，將水注滿10 mL玻璃刻度管，保持大鼠足部垂直插入水中至標記處后取出，動作盡量保持輕柔，再用裝滿水的5 mL注射器加水至原有水面高度，記錄注射器中剩余水量，其差值即為足爪所排出的水量，每次由專人進行測量，每次每只足爪測量2次取平均值。

1.5.4 ELISA 法檢測血清細胞因子含量末次給藥、治療和行為學測定后禁食禁水12 h，腹腔注射1%戊巴比妥納（50 mg/kg）麻醉，將大鼠仰頭固定于手術臺，腹主動脈采血，真空管收集全血標本，室溫放置1 h 后離心半徑13.5 cm，3000 r/min 離心15 min，取上清液-20℃保存。采用ELISA 法檢測大鼠血清IL-17、IL-6、IL-10、IL-23和TGF-β含量。

1.6 統計學方法采用SPSS 17.0 統計軟件分析數據，計量資料以±s表示，組間兩兩比較方差齊時采用LSD-t法，方差不齊采用Dunnett"s T3法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況大鼠造模后出現體質量增長緩慢、食欲下降，足部明顯腫脹、紅腫，活動明顯受限。

2.2 AI 指數評分大鼠造模后3 天AI 指數評分各組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。干預后（第1療程），各組AI指數較模型組下降（P＜0.01），且在2、3療程有下降趨勢。見表1。

表1 各組大鼠不同時間點AI指數評分比較（±s） 分

表1 各組大鼠不同時間點AI指數評分比較（±s） 分

注：*表示與模型組比較，P＜0.01

2.3 大鼠足爪容積與正常組比較，造模后各組大鼠足爪容積均增加（P＜0.01）；第1 療程刺山柑組與正常組比較差異無統計學意義（P＞0.05）；第2 療程陽性藥組與正常組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。與模型組比較，第1 療程刺山柑組降低（P＜0.05），陽性藥組在第2療程降低（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠不同時間點足爪容積比較（±s） mL

表2 各組大鼠不同時間點足爪容積比較（±s） mL

注：與正常組比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；與模型組比較，#表示P＜0.05，##表示P＜0.01

2.4 血清IL-17、IL-6、IL-10、IL-23 和TGF-β 含量與正常組比較，模型組血清IL-17、IL-6、IL-23升高（P＜0.05），TGF-β、IL-10 降低（P＜0.05）；陽性藥組IL-6 高于正常組（P＜0.05），刺山柑組TGF-β低于正常組（P＜0.05）。與模型組比較，陽性藥組和刺山柑組IL-17、IL-6含量均降低（P＜0.05），IL-10 升高（P＜0.01）；刺山柑組IL-23 含量降低（P＜0.05）；各組TGF-β水平與模型組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各組大鼠血清IL-17、IL-6、IL-10、IL-23和TGF-β、比較（±s） ph/mL

表3 各組大鼠血清IL-17、IL-6、IL-10、IL-23和TGF-β、比較（±s） ph/mL

注：與正常組比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；與模型組比較，#表示P＜0.05，##表示P＜0.01

3 討論

目前在RA 的治療方面，西醫主要以改善癥狀和緩解病情為主，民族醫藥在RA 的治療方面療效確切且安全、毒副作用小，有一定優勢［5-6］。刺山柑屬白菜花科山柑屬植物，原產于地中海地區，目前在我國主要分布在新疆、西藏、貴州等地，尤其在沙漠分布較多的新疆地區資源豐富。刺山柑的根、果、葉均能入藥，諸多藥理實驗表明，刺山柑果實較其他藥用部位更具有抗急性炎癥作用［7］。刺山柑在治療RA 方面具有祛風除濕、消炎止痛等功效［8］，其可能的作用機制是免疫抑制［9］、鎮痛、抗炎和抑制軟骨和骨破壞等作用［10］。

調節性T 細胞（regulatory T cell，Treg）和輔助性T 淋巴細胞17（T helper cell 17，Th17）參與自身免疫疾病、腫瘤、感染等多種疾病的發生和發展［11］。研究表明，保持RA 免疫穩態存在Th17/Treg 平衡［12］，二者的抑炎及促炎性作用相輔相成［13-14］，在RA 患者外周血中Th17/Treg 比值明顯升高，并且與疾病活動度相關［15］。

Treg在許多自身免疫性疾病中較為關鍵［16-17］，具有降低炎性細胞因子產生抗體分泌功能，維持機體免疫內環境平衡的作用。與Treg 功能相反，Th17 可促進自身免疫性疾病發生并介導促炎反應［18］，主要分泌炎癥介質IL-17。IL-17在RA中起關鍵作用，是一種重要的促炎性、前炎性細胞因子和炎癥反應的微調因子，能夠通過多種途徑參與RA 的炎癥反應和進行性損害。IL-17 既可以通過與其他細胞因子的相互作用以促炎，又可進一步誘導產生、釋放其他炎性因子，從而逐級放大炎癥效應，導致RA 疾病的發生發展［19］。在維持Th17/Treg平衡中TGF-β的地位尤為重要，既可影響Th17細胞分化，又參與調節Treg 功能［1］。IL-10 是由Treg釋放的有發揮其抑制T細胞及抗原呈遞細胞的功能；IL-6 是多效性致炎性因子，由Treg細胞分泌產生，可誘導Th17細胞分化；IL-23主要在Th17細胞分化功能維持階段起主要作用［9］。

本研究結果表明，佐劑型關節炎模型大鼠血清IL-17、IL-6、IL-23 升高，TGF-β降低。兩種干預方法均可有效降低主要由Th17 細胞分泌的促炎因子IL-17，此外，刺山柑還可有效降低Treg細胞分泌的致炎因子IL-6，升高抑炎因子IL-10，對于Th17和Treg分化共用的，具有雙向作用的調節細胞因子TGF-β，以及主要起Th17 細胞分化功能維持作用的IL-23 無顯著改變，其具體機制有待進一步研究。因此，刺山柑可能是通過調節Th17和Treg 細胞水平，改善佐劑型關節炎大鼠免疫細胞Th17/Treg 失衡狀態，從而發揮其消炎及抑制足腫脹等作用。