祛風通絡方對單側輸尿管梗阻大鼠肺腎組織AQP4 表達的影響?

劉 艷，謝 君，王 竹，李睿萍，孫萬森△

1 西安交通大學第二附屬醫院，陜西 西安710004；2 西安市胸科醫院

汪昂《醫方集解》云：“肺為水之上源，腎為水之下源”，水通道蛋白（aquaporin-4，AQP4）與機體水液代謝密切相關。本研究觀察AQP4在單側輸尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO）大鼠肺、腎組織的不同表達及祛風通絡方的干預作用，探求肺、腎在水液代謝過程中的分子生物學基礎，為祛風通絡方的臨床應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 動物與藥品健康SPF 級雄性成年SD 大鼠40 只，體質量（200±20）g，由西安交通大學醫學院動物實驗中心提供，實驗動物合格證號：SCXK（陜）2017-001；纈沙坦膠囊（代文，北京諾華制藥有限公司，國藥準字H20040217，規格：80 mg/片）；祛風通絡方購于西安交通大學第二附屬醫院草藥房，由黃芪、烏梢蛇、防風、海風藤、生地黃、桑寄生組成，每劑含生藥130 g。

1.2 實驗試劑兔抗大鼠一抗（美國Santa Cruz 公司，批號：sc-32739）；SP 試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司，批號：SP-9001）；Anti-Aquaporin 4 antibody（美國abcam 公司，批號：ab952）；Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody（批號：L3031）及Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody（批 號：L3011）均 由Signalway antibody 公司提供；總RNA 極速抽提試劑盒（上海飛捷生物技術有限公司，批號：RNAfast200）；PrimeScript RT Master Mix（TaKaRa 公 司，批號：RR036A）；SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ（TaKaRa公司，批號：RR820A）。

1.3 動物分組及模型制備48 只大鼠適應性喂養1 周后按隨機數字表法選出8 只作為空白組。剩余40只采用單側輸尿管結扎法［1］建立大鼠腎病模型，1 周后從造模大鼠中按隨機數字表法抽取8只，腹腔注射10%水合氯醛（0.4 mL/100 g）麻醉，取大鼠腎臟組織HE 染色，若見大量腎小管萎縮，炎癥細胞浸潤，大量基質沉積，提示造模成功［2］。將造模成功32 只大鼠按隨機數字表法分為模型組、纈沙坦組及祛風通絡方大、小劑量組，每組8 只。術后第一天開始灌胃，祛風通絡方大、小劑量組分別給予2、1 g/mL濃度藥液2 mL，空白組、模型組灌服等體積生理鹽水，每日1次，共20天。給藥結束后處死大鼠，取術側肺、腎組織，一半置于4%多聚甲醛溶液中固定，脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋，一半用生理鹽水沖洗、吸干后液氮速凍，置-80℃冰箱保存。

1.4 觀察指標及方法

1.4.1 免疫組化法檢測肺、腎組織AQP4表達石蠟切片梯度酒精脫蠟后以微波熱修復進行抗原修復，低火微波加熱3 min，高火10 min，室溫放置60 min，一抗按l∶200 進行稀釋，4℃過夜，PBS 沖洗4次后滴加二抗，DBA顯色，脫水、封片。每個組織取3 張切片，各觀察3 個視野，用Image-pro pluss 6.0 彩色圖像分析系統分別掃描測量陽性細胞的積分光密度值，進行統計分析。

1.4.2 Western blot 檢測肺、腎組織AQP4 蛋白表達分別取大鼠肺、腎組織100 mg研磨，加入裂解液（比例：600～700μL/100 mg）混勻，充分裂解后，轉移至離心管，4℃，離心半徑8 cm，1500 r/min，離心15 min，-20℃保存。Western blot步驟：制膠，電泳，轉膜，封閉，傾去封閉液，加入一抗（1∶600），4℃過夜，將PVDF 膜用PBST 洗4 次，每次10 min，加入二抗（山羊抗小鼠，1∶10 000），搖床上孵育1.5 h 后回收二抗，再將PVDF膜用PBST洗3次，每次10 min。計算機掃描記錄結果，采用美國BIO-RAD公司的Quantity One 軟件半定量分析檢測條帶的灰度值。

1.4.3 RT-PCR 法檢測胃及腎組織AQP4 mRNA 表達分別取大鼠肺、腎組織100 mg，總RNA 提取按照RNAfast200總RNA極速抽提試劑盒說明書進行，按逆轉錄試劑盒Prime Script RT Master Mix 說明書進行操作，逆轉錄成cDNA，以GAPDH為內參擴增AQP4 基因片段，引物序列由生工生物工程股份有限公司合成。按照實時熒光定量PCR 試劑盒說明書配制反應體系，PCR條件為：95℃預變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火并延伸30 s，40 個循環。溶解曲線分析產物特異性，參數為95℃變性15 s，60℃退火30 s，95℃延伸15 s。在凝膠成像分析儀上成像，計算AQP4 mRNA和GAPDH mRNA平均吸光度比值。引物序列見表1。

表1 AQP4及GAPDH的引物序列

1.5 統計學方法采用SPSS 19.0 統計軟件分析數據，計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠肺、腎組織AQP4 表達各組大鼠肺、腎組織AQP4積分光密度表達結果見表2及圖1—2。

表2 各組大鼠肺、腎組織AQP4積分光密度表達（±s）

表2 各組大鼠肺、腎組織AQP4積分光密度表達（±s）

注：*表示與空白組比較，P＜0.01；△表示與模型組比較，P＜0.01；▲表示與祛風通絡方小劑量組、纈沙坦組組比較，P＜0.05

圖1 各組大鼠肺組織AQP4表達（免疫組織化學法，×200）

圖2 各組大鼠腎組織AQP4表達（免疫組織化學法，×200）

2.2 大鼠肺、腎組織AQP4 western blot 檢測結果各組大鼠肺組織中AQP4蛋白表達結果見表3及圖3—4。

2.3 大鼠肺、腎組織AQP4 RT-PCR檢測結果各組大鼠肺、腎組織AQP4 RT-PCR含量變化見表4。

表3 各組大鼠肺、腎組織中AQP4蛋白含量的變化（±s）

表3 各組大鼠肺、腎組織中AQP4蛋白含量的變化（±s）

注：*表示與空白組比較，P＜0.01；△表示與模型組比較，P＜0.01；▲表示與祛風通絡方小劑量組、纈沙坦組組比較，P＜0.05

圖3 各組大鼠肺組織中AQP4蛋白表達Western blot結果

圖4 各組大鼠腎組織中AQP4蛋白表達Western blot結果

表4 各組大鼠肺、腎組織AQP4 mRNA含量的變化（±s）

表4 各組大鼠肺、腎組織AQP4 mRNA含量的變化（±s）

注：*表示與空白組比較，P＜0.01；△表示與模型組比較，P＜0.01；▲表示與祛風通絡方小劑量組、纈沙坦組比較，P＜0.05

3 討論

AQP 是一種生物膜通道蛋白，是細胞膜上與水的跨膜轉運密切相關的轉運蛋白家族，AQP4 是水通道蛋白家族中的一員，其在腎臟主要表達于內髓集合管上皮細胞基底膜及近曲小管上皮的頂質膜內側囊，在呼吸系統主要表達于氣道黏膜上皮及肺泡上皮細胞［3-4］。AQP是機體水液轉運和代謝的重要生物學基礎［5］。機體的水液代謝依賴于肺氣的宣降，腎陽的蒸化和脾的轉輸，而三焦是水液升降的通道，由于肺居上而腎居下，籍三焦而相互連系共司行水之機，所以有“肺為水之上源，腎為水之下源”之說［6］。水濕既是慢性腎臟疾病的主要致病因素，也是其主要病理產物，故治腎病必當治水濕。祛風通絡方是以“腎絡空虛，風伏腎絡，水濕不化，久則腎絡不通”為病機而組成的治療慢性腎臟疾病的中藥復方，該方具有保護腎小球濾過屏障、減輕尿蛋白、抑制系膜細胞增殖、延緩腎小球硬化進展、保護腎功能等作用［7-8］。

本研究結果發現，UUO 模型組AQP4 的表達減少，各治療組AQP4 表達增加，其中祛風通絡方大劑量組增加較明顯，且肺、腎組織中AQP4的表達呈一致性，可見祛風通絡方可通過調節肺、腎AQP4的表達來改善機體水液代謝功能，從而達到防治慢性腎臟疾病的目的。但是其療效是否存在劑量及依賴關系，或者在慢性腎臟疾病治療中是否存在最佳劑量及取得最好的療效，尚需要進一步研究。AQP4的表達受到多種因素調節，不同組織和病理狀態下，其調控方式不盡相同，需要深入研究。