化痰散結方對人胃癌MKN45 細胞的體內外抑制作用?

王 華，郭 維，2△，孫 琪，2

1 寧夏醫科大學中醫學院，寧夏 銀川750004;2 寧夏醫科大學回醫藥現代化教育部重點實驗室

胃癌是常見的消化道腫瘤，因其侵襲和轉移致預后極差，死亡率高［1］。中醫認為，痰濁與胃癌的發病關系密切。痰的特點是膠著難去，隨氣升降，無處不到［2-3］，其特點與腫瘤的特性十分相似。《丹溪心法》曰：“凡人身，上中下有塊者，多是痰。”充分說明痰與腫瘤的關系［4］。基于此，化痰法治療腫瘤成為臨床常用的大法，本課題組前期自擬化痰散結方治療胃癌，取得較好療效，現進一步探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞和動物MKN45 人胃癌細胞株（中國科學院上海生科院細胞資源中心）；健康SD 雄性大鼠10 只，由寧夏醫科大學實驗動物中心提供，實驗動物許可證號：SCXK90（寧）2015-0001；BALB/C裸鼠，均選用雄性裸鼠24 只，體質量（21±2）g，在寧夏醫科大學動物中心SPF 條件下飼養，實驗動物許可證號：SCXK（京）20160006。

1.2 藥物化痰散結方藥物組成：半夏15 g，天南星15 g，浙貝10 g，生牡蠣30 g，全蝎6 g，地龍6 g，守宮6 g，烏賊骨15 g，炙甘草6 g，木蝴蝶15 g，鳳凰衣15 g，刺猬皮10 g，山甲粉3 g，蜈蚣6 g，藤梨根15 g，由寧夏醫科大學附屬回醫中醫醫院制成濃度為1.56 g/mL 的水煎劑。注射用5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-Fu）由上海旭東海普藥業有限公司生產。

1.3 試劑與儀器胎牛血清（gibco，批號：1739463）；CCK-8 試劑(日本同仁化學，批號：LK815)；胰蛋白酶(北京索萊寶生物有限公司，批號：T1302)；PBS緩沖液（批號：AD20616267）、RPMI-1640 培養基（HyClon 公司,批號：AC10375291)；OB 醫用吻合膠（廣州白云山醫藥集團股份有限公司，批號：160108）。恒溫CO2培養箱HF-90（Thermo Scientific）；倒置顯微鏡CKX31（OLYMPUS Corporation）；連續波長及核酸蛋白微量檢測酶標議（Tecan 瑞士）。

1.4 方法

1.4.1 細胞培養及分組將MNK45 胃癌細胞分別接種于T25的培養皿中，5%CO2、37℃培養箱中培養，待細胞生長成對數生長期進行實驗。按照處理條件不同分為空白血清組及5%、10%、15%、20%含藥血清組。

1.4.2 含藥血清的制備SD 大鼠10 只，體質量（180±20）g，適應性飼養7 天后隨機分為空白組和給藥組，每組5 只。給藥組給予化痰散結方藥液（濃度1.56 g/mL），空白組給予等劑量生理鹽水，每日1次，每次灌胃2 mL，連續7天。末次灌藥（灌藥前禁食不禁水12 h）2 h后，10%水合氯醛麻醉，心尖采血，靜置2 h后，離心半徑16 cm，3500 r/min離心10 min后收集血清，同組血清混合置于離心管中，用0.22μm微孔濾膜過濾除菌，-80℃分裝保存備用。

1.4.3 CCK-8 法檢測胃癌細胞株增殖用胰酶消化處于對數生長期細胞，用培養基分別稀釋成細胞懸液，接種于96 孔板中，每孔100μL（5×103個/孔），培養24 h，待細胞貼壁。棄去原有培養液，加無血清培養液，饑餓12 h 后，分別加入含藥血清或空白血清培養液100 μL，繼續分別培養24、48、72 h。每孔加入10μL CCK-8 溶液，再培養1 h。用酶聯免疫檢測儀在波長450 nm 處讀取光密度（OD 值），計算抑制率。每組每時段均設3 個重復孔。抑制率（%）=［1-（給藥組OD 值/空白對照組OD值）］×100%。

1.5 裸鼠移植瘤的建立與分組培養胃癌細胞至對數期，配制成細胞濃度為1×107cells/100μL PBS 的細胞懸液，接種于裸鼠右側腋下皮膚，每只0.2 mL。待瘤體生長至直徑約10 mm 時取出瘤塊，將瘤塊送至裸鼠右腋下生長至10 mm時，再重復上述過程進行傳代，此過程反復3 次，并將瘤塊切成小組織塊備用。術前禁食12 h，麻醉，消毒皮膚后，在鼠胃大彎側血管豐富區劃開，觀察到出血后將組織塊接種于此，滴少量OB 膠，待粘合牢固后，逐層關腹。造模24 h 后開始給藥，將裸鼠分為模型組灌胃生理鹽水0.02 mL/g，中藥組灌胃化痰散結方湯劑0.02 ml/g，每天1 次，5-fu 組腹腔注射25 mg/kg，隔天1 次，連續4 周。停藥后將裸鼠處死，開腹取腫瘤，并稱重。抑瘤率（%）=［1-（給藥組平均瘤重/模型組平均瘤重）］×100%。

1.6 統計學方法采用SPSS 22.0 軟件分析數據，計量資料以±s表示，采用單因素方差分析，組間多重比較用LSD-t，檢驗水準為α=0.05。

2 結果

2.1 一般情況模型組裸鼠飲食減少，活動度較差，后期出現消瘦。中藥組裸鼠飲食量、活動度和精神狀態較穩定。5-fu 組裸鼠相繼出現糞質偏稀，食欲減退，活動度欠佳。中藥組較其他兩組在改善一般狀況方面作用較好。

2.2 化痰散結含藥血清對MKN45 胃癌細胞株增殖的影響與空白血清組比較，化痰散結含藥血清能不同程度抑制MKN45 細胞增殖，呈現出劑量-效應關系。見表1、圖1。

表1 化痰散結含藥血清對MKN45胃癌細胞株增殖的影響（±s）

表1 化痰散結含藥血清對MKN45胃癌細胞株增殖的影響（±s）

注：#表示與空白血清組比較，P＜0.05；□表示與5%含藥血清組比較，P＜0.05；*表示與10%含藥血清組比較，P＜0.05；△表示與15%含藥血清組比較，P＜0.05

圖1 化痰散結含藥血清對MKN45胃癌細胞抑制率的影響

2.3 化痰散結方對移植瘤生長的抑制作用瘤質量中藥組和5-fu 組與模型組相比，差異均有統計學意義（P＜0.01）。5-fu 組和中藥組的抑瘤率分別為57.81%和44.53%，提示5-fu 組抑瘤效果較中藥組好。小鼠體質量模型組治療前后比較差異無統計學意義（P＞0.05），5-fu 組、中藥組與模型組比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。提示在改善生存質量方面中藥組優于西藥組。見表2―3。

表2 各組裸鼠瘤質量和抑瘤率比較（±s）

表2 各組裸鼠瘤質量和抑瘤率比較（±s）

注：#表示與模型組比較，P＜0.01

表3 各組裸鼠治療前后體質量比較（±s） g

表3 各組裸鼠治療前后體質量比較（±s） g

注：與模型組治療后比較，△表示P＜0.05，#表示P＜0.01

3 討論與展望

腫瘤乃有形實邪，治療多用“結者散之”“堅者削之”法。化痰散結法聯合化療能改善中晚期胃癌患者生存質量，增效減毒［5］；溫陽化痰散結方能抑制乳腺癌荷瘤鼠腫瘤生長，改善生存期［6］。化痰散結類中藥能抑制腫瘤生長轉移［7］，逆轉耐藥［8］。本研究結果表明，化痰散結方含藥血清對MKN45 細胞的抑制增殖呈現時間和濃度相關性。通過一般情況（如精神狀態、飲食量、活動度等）可知，5-fu 組化療副作用明顯。總之，化痰散結方可抑制胃癌MKN45 細胞生長增殖，改善裸鼠生存質量。

胃癌屬中醫學“積聚”“癥瘕”等范疇。《瘍科心得集》云：“癌瘤者，非陰陽正氣所結腫，乃五臟瘀血濁氣痰滯而成。”郭維導師在臨床診治中體會到，腫瘤非單一邪氣所為，也非單純寒證和熱證，而是寒熱膠結［9］，再與痰瘀等邪氣相合，日久成積化毒致癌。方中半夏、天南星燥濕化痰，浙貝、生牡蠣軟堅散結為君藥。全蝎、地龍、守宮、蜈蚣和山甲粉通絡散結為臣藥。現代藥理研究［6-7］證明一些動物藥中所含成分具有抑制或殺滅癌細胞、增強機體對腫瘤的免疫力、抑制轉移、止癌性疼痛等作用。木蝴蝶和胃，鳳凰衣養陰，刺猬皮散瘀止痛，烏賊骨制酸消炎止痛，藤梨根清熱解毒活血為佐藥。炙甘草調和諸藥為使藥。該方辛開苦降，寒熱并用，具有化痰散結，和胃止痛，養陰解毒之功。

此外，胃癌MKN45 細胞株是否為痰濕凝結證型，化痰散結方對其他胃癌細胞株的作用及胃癌細胞株與中醫胃癌證型相關性（即某一種細胞株能否代表某種疾病的證型），后期將通過其他胃癌細胞株進行探討。