金剛藤及小果倒地鈴合劑對STZ 誘導的糖尿病小鼠胰腺β 細胞的抗炎及抗氧化作用?

謝 科，翁 靜，李 騏，尚曉麗，楊 斌，錢興勇，劉 威△

1 楚雄醫藥高等專科學校基礎醫學系，云南 楚雄675005；2 楚雄州人民醫院

糖尿病是由遺傳因素、免疫功能紊亂等各種致病因子作用于機體導致胰島功能減退、胰島素抵抗等而引發一系列代謝紊亂綜合征，是嚴重危害人類身體健康的一種疾病。國際糖尿病聯盟數據顯示，2014 年全世界有3.87 億糖尿病患者，在高收入國家，2型糖尿病占85%～95%［1］。隨著社會經濟的發展、人們生活方式的改變（能量攝入增加和運動減少等）及人口老齡化等因素的影響，2 型糖尿病的發病在全球范圍內，尤其在發展中國家呈逐漸加重的流行趨勢［2］。目前尚缺乏根治糖尿病的藥物，多以西藥為主，能控制血糖，但隨著用藥時間的延長，耐藥性的出現，降糖效果降低，器官損害嚴重，出現各種糖尿病并發癥；中藥治療糖尿病具有降低血糖、減輕糖尿病對機體損害及控制、延緩糖尿病并發癥，保護靶器官，高效、低毒，較少產生耐藥性等優勢［3］。金剛藤，又名菝葜，相關研究［4］發現，其提取物有較強的抗氧化活性，可有效抑制因胰島素抵抗導致體內糖脂代謝紊亂所啟動的氧化應激機制，減少氧化應激對胰島β細胞的損傷和功能抑制。小果倒地鈴為無患子科小果倒地鈴屬植物，有研究［5］發現小果倒地鈴葉乙醇提取物能降低血糖和糖化血紅蛋白（glycosylated hemoglobin，HbA1c），增加胰島素和血紅蛋白水平。筆者團隊就金剛藤+小果倒地鈴合劑（以下簡稱“合劑”）的降血糖作用進行研究，探討合劑對成模小鼠的胰腺修復作用，為合劑藥理學的進一步研究提供參考，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 試藥及相關藥劑金剛藤和小果倒地鈴購自云南楚雄市藥材市場，已通過楚雄醫藥高等專科學校相關專家鑒定。其中小果倒地鈴提取物由本實驗室經乙醇提取法取得。鹽酸二甲雙胍片（山東鳳凰制藥股份有限公司，批號：1803312）；胰島素檢測試劑盒(Mouse Insulin ELISA Kit，RayBiotech,貨號：Inc）；葡萄糖測試盒（中生北控生物科技股份有限公司，批號：193691）；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ，美侖生物，批號：MB1227-1g）；三諾血糖測試紙（三諾生物傳感股份有限公司，批號：4801NB）；兔抗Tribble 同源蛋白3（TRIB3）多克隆抗體購自德國Calbiochem 公司；兔抗小鼠C/EBP 同源蛋白（CHOP）高親和性單克隆抗體購自美國Sigma公司。

1.2 儀器設備CA400型全生化自動分析儀（日本谷野株氏會社）；LD5-10 型離心機（北京醫療器械有限公司）；型移液槍（上海佳安分析儀器廠）；全自動血糖儀［艾康生物技術（杭州）有限公司，型號（艾科·靈睿），標準編號：YZB/浙4540-2015］；電泳儀（美國Bio-Rad 公司）；9602A 酶標儀（北京艾普生物設備有限公司）。

1.3 實驗動物8 周齡KM 雄性小鼠30 只，體質量（200±20）g，由楚雄醫藥高等專科學校實驗動物中心提供，實驗動物合格證號：43004700050652，適應性喂養1周。

1.4 方法

1.4.1 動物模型制備與分組8 周齡KM 雄性小鼠30 只，適應性喂養1 周，隨機分為對照組10 只（空白對照組和合劑對照組）和造模組20 只，并測定兩組零基準血糖值和初始體質量；空白對照組常規飼養，正常飲水，灌胃生理鹽水；合劑對照組常規飼養，正常飲水，灌胃合劑13.5 g/kg；各組按飼養方法飼喂4 周，每周測血糖和體質量；第5 周開始將造模組小鼠腹腔注射STZ（40 mg/kg），連續注射5 天，對照組注射枸櫞酸鈉緩沖溶液；最后1次注射后72 h（禁食12 h）小鼠尾靜脈采血，血糖值大于11.1 mmol/L的小鼠為建模成功小鼠，選擇15只成模小鼠。

1.4.2 給藥方法將成模小鼠隨機分為模型組、合劑組及二甲雙胍組。金剛藤小果倒地鈴合劑制備：采取水萃法，取金剛藤30 g與小果倒地鈴60 g混合，10倍加水量，浸泡1 h，煎煮3次，第1次2 h，第2、3 次1 h，提取液分別過濾合并，將濾液置蒸發皿中水浴蒸干，于105℃干燥3 h 取出稱重，將蒸發皿室溫放置0.5 h 后再干燥1 h 后稱重，反復操作，至兩次質量差小于5%，掃出蒸發皿中的金剛藤小果倒地鈴干膏稱重備用，算出膏率和生藥含量系數并記錄；出膏率（%）=干膏質量/生藥質量×100%；生藥含量系數=生藥質量/干膏質量，計算所得干膏率為26.5%。將干膏換算成生藥含量并配制成0.675 g/mL濃度的溶液，冰箱冷藏備用。1）空白對照組：常規飼養，正常飲水，灌胃生理鹽水，連續8 周；2）合劑對照組：常規飼養，正常飲水，灌胃合劑13.5 g/kg，連續飼養8 周；3）模型組：飼喂高糖高脂飼料，正常飲水，灌胃生理鹽水，連續8 周；4）合劑組：飼喂高糖高脂飼料，正常飲水，灌胃合劑13.5 g/kg，連續8周；5）二甲雙胍組：飼喂高糖高脂飼料，正常飲水，灌胃二甲雙胍片溶液250 mg/kg，連續8周。

1.5 指標檢測分別于給藥前和末次給藥后1 h測定成模組和對照組小鼠空腹血糖、血漿胰島素水平；切除小鼠部分胰腺組織勻漿后采用ELISA法檢測腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factorα，TNF-α）、一氧化氮（nitric oxide，NO）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）及核轉錄因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）水平；Western blot法檢測胰腺組織TRIB3及CHOP蛋白表達。

1.6 統計學方法采用SPSS 20.0 軟件分析數據，計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；各指標間相關性采用多元線性回歸方程，P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 FBG 和血漿胰島素水平FBG 和血漿胰島素水平空白對照組與合劑對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）；與空白對照組和合劑對照組比較，末次給藥后模型組、合劑組、二甲雙胍組空腹血糖升高，胰島素降低（P＜0.05）；與模型組比較，合劑組FBG降低，胰島素升高（P＜0.05），見表1。

2.2 炎癥指標及TRIB3、CHOP 蛋白表達水平空白對照組和合劑對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）；與空白對照組、合劑對照組比較，末次給藥后模型組、合劑組、二甲雙胍組TNF-α、NO、ROS、NF-κB 及TRIB3、CHOP 升高（P＜0.05），合劑組低于模型組（P＜0.05），見表2—3、圖1。

2.3 炎癥指標與相關蛋白表達水平的相關性TRIB3、CHOP 表達與TNF-α、NO、ROS、NF-κB 水平呈顯著正相關（P＜0.05），見表4。

表1 各組小鼠FBG和胰島素水平比較（±s）

表1 各組小鼠FBG和胰島素水平比較（±s）

注：#表示與空白對照組和合劑對照組比較，P＜0.05；*表示與模型組比較，P＜0.05

表2 各組小鼠炎癥指標比較（±s）

表2 各組小鼠炎癥指標比較（±s）

注：#表示與空白對照組和合劑對照組比較，P＜0.05；*表示與模型組比較，P＜0.0

圖1 TRIB3與CHOP蛋白表達水平（HE，×200）

表3 各組小鼠相關蛋白表達水平比較（±s）

表3 各組小鼠相關蛋白表達水平比較（±s）

注：#表示與空白對照組和合劑對照組比較，P＜0.05；*表示與模型組比較，P＜0.05

表4 炎癥指標與相關蛋白表達水平的相關性分析

3 討論

2 型糖尿病的發生發展均伴隨胰島β細胞功能的進行性減退，改善胰島β細胞功能、抑制β細胞凋亡是延緩2 型糖尿病進展和并發癥發生的重要作用靶點［6］。盡管當前可用的藥物（例如胰島素和其他降血糖藥物）可有效控制高血糖，但許多糖尿病患者最終會出現血管并發癥［7］。隊列研究［8］表明，殘留的β細胞功能可抵抗糖尿病并發癥的發展，表明可以長期保存β細胞質量/功能的治療方法具有重要價值，似乎內源性胰島素釋放的增加較外源性胰島素替代具有多個優勢。因此，在早期診斷的患者中保持β細胞存活并在慢性糖尿病患者中恢復β細胞質量/功能將是糖尿病長期管理的一個重點。目前已有多項研究［9-10］顯示，誘導胰島β細胞凋亡的因素較多，主要以高血糖狀態、內質網應激及氧化損傷為主。在氧化損傷誘導β細胞凋亡的多種途徑中，NF-κB 的活化、誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）的激活已引起關注，但具體機制尚未闡明。近年中藥制劑在糖尿病管理方面發揮了越來越重要的作用。諸多研究［11-12］表明，植物化學物質，特別是類黃酮對糖尿病的預防和治療具有有益作用。研究含黃酮類成分的中藥制劑是否通過抑制氧化和內質網應激以及激活其抗氧化，抗炎和抗凋亡作用來保護胰腺β細胞并改善其功能進而達到防治糖尿病的目的，已成為近年來相關專家關注的熱點問題。

本研究發現，末次給藥后模型組、合劑組、二甲雙胍組空腹血糖水平高于對照組，血清胰島素水平低于對照組，且與模型組比較，合劑組FBG 水平更低，血清胰島素水平更高，說明金剛藤及小果倒地鈴合劑能夠有效降低機體血糖水平，保護胰腺β細胞功能和質量。提示金剛藤提取物有較強的抗氧化活性，可有效抑制因胰島素抵抗導致體內糖脂代謝紊亂所啟動的氧化應激機制，減少氧化應激對胰島β細胞的損傷和功能抑制。小果倒地鈴為無患子科小果倒地鈴屬植物，CHINNADURAI等［4］研究小果倒地鈴葉的乙醇提取物降血糖作用，發現小果倒地鈴葉乙醇提取物能降低血糖和糖化血紅蛋白HbA1c 水平，增加機體胰島素和血紅蛋白水平。

此外，本研究結果顯示，與對照組比較，模型組、合劑組、二甲雙胍組TNF-α、NO、ROS、NF-κB 及TRIB3、CHOP 水平高于對照組，合劑組上述指標水平低于模型組；且多元線性回歸分析結果顯示TRIB3、CHOP 表達與TNF-α、NO、ROS、NF-κB 水平存在正相關。內質網是蛋白質合成、加工修飾的重要場所，且內質網應激是真核細胞的一種保護性應激反應；持續的內質網應激會激活細胞凋亡通路［13］。胰島β細胞具有高度發達的內質網，其蛋白質合成分泌旺盛，這就使得內質網應激對β細胞功能和狀態極為敏感。糖尿病患者機體處于持續高血糖狀態，胰腺β細胞在長期高糖環境下會造成作為細胞器的內質網處于長期性應激反應，誘導細胞功能衰竭、損害細胞功能、減少細胞數量。這種高應激狀態會導致胰島組織中產生大量炎癥因子，進而出現炎癥級聯反應，直接或間接作用于胰腺并損傷胰島β細胞。NF-κB 的高表達會啟動胰腺組織中的iNOS 因子，誘導NO 生成，觸發內質網應激反應，造成胰島β細胞凋亡；TNF-α受體（TNFR-1）活化會觸發一系列細胞內信號，最終導致Caspases-3 和-7 的激活，導致β細胞凋亡；TNFR-1 的活化能夠通過necrosome 的形成開始啟動β細胞自噬和壞死的通路［14］。細胞內葡萄糖和FFA 的氧化會產生過量ROS/RNS，從而通過內在途徑誘導β細胞凋亡。細胞內葡萄糖水平的升高促進了醛糖還原酶（一種消耗NADPH 的反應）產生的山梨糖醇；NADPH 的耗盡會減少還原型谷胱甘肽（一種重要的細胞內抗氧化劑）的再生，從而使細胞易于受到氧化損傷，ROS/RNS 水平升高會破壞蛋白質和DNA，從而誘導細胞凋亡或觸發以自噬或壞死性死亡為終點的途徑［15］。TRIB3 是重要的應激反應相關蛋白，其通過調控下游炎癥因子、氧化因子、營養因子等來參與調節細胞增殖、遷移和凋亡。研究顯示［16］，在內質網應激狀態下抑制TRIB3 表達可降低細胞應激損傷所造成的細胞程序性凋亡。CHOP 作為C/EBP 轉錄因子家族成員，當內質網處于普通狀態時，CHOP 蛋白處于低表達狀態，當內質網應激時其表達會增加，故可作為衡量糖尿病動物胰島內質網應激反應的指標［17］。

合劑的主要成分為金剛藤和小果倒地鈴，兩種中草藥的化學成分均含有類黃酮成分；黃酮類化合物可通過增強酶促（例如過氧化氫酶，谷胱甘肽過氧化物酶，谷胱甘肽S 轉移酶，超氧化物歧化酶）和非酶促（例如還原型谷胱甘肽）抗氧化劑來增強糖尿病動物β細胞的抗氧化能力；抗氧化能力的提高抑制了β細胞中ROS 的積累和脂質過氧化，因此可以保護它們免于自噬，凋亡或壞死。此外，有研究［18］表明，類黃酮對β細胞存活的有益作用與ER 應激標志物的減少有關。由于線粒體來源的ROS 在細胞因子敏感性NF-κB 的激活中起重要作用，因此類黃酮的抗氧化作用可能是抑制NF-κB激活和iNOS表達的原因。類黃酮可增加胰島素產生細胞中熱激蛋白（例如Hsp70）的基因表達［19］，熱休克蛋白70 的上調顯示增強了β細胞對NO、ROS和其他毒素（包括STZ）的抗性。

本研究受到實驗動物數量的限制，且金剛藤和小果倒地鈴降血糖的作用機理仍需進一步化學分離和藥理學研究。

綜上所述，金剛藤與小果倒地鈴合劑可能具有通過抑制氧化和內質網應激以及激活其抗氧化、抗炎和抗凋亡作用來保護胰腺β細胞并改善其功能的潛力。