蛭龍活血通瘀膠囊對家兔頸動脈粥樣硬化斑塊組織p-NF-κB、NLRP3 表達的影響?

劉孟楠，羅 鋼，劉 平，劉佳利，劉 顏，周 華，楊思進△

1 西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院心血管內科，四川 瀘州646000；2 澳門科技大學中醫(yī)藥學院

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）危害巨大，是誘發(fā)冠心病、心肌梗死、腦梗死等疾病的主要原因［1］。血脂代謝紊亂與AS的發(fā)生發(fā)展關系密切，在動物實驗研究、流行病學研究及臨床試驗中已達到共識［1］。近年來研究報道膽固醇結晶可作為內源性信號分子激活NLRP3 炎癥小體，促進炎癥因子的成熟與分泌，介導AS早期炎癥反應［2］，而核轉錄因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)磷酸化與NLRP3炎癥小體的激活關系密切，通過活化NFκB模式識別受體或細胞因子受體可啟動NLRP3炎癥小體介導的細胞凋亡［3］，表明p-NF-κB、NLRP3炎癥小體參與了AS的發(fā)生和發(fā)展。

目前對于AS 及血脂紊亂的治療重點在于改善低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C），隨著他汀類藥物的廣泛應用，血脂的調理更為科學有效，但AS 的危險性仍然存在［4］。針對AS誘發(fā)的冠狀動脈粥樣硬化性心臟病，楊思進教授研發(fā)蛭龍活血通瘀膠囊“補氣通絡，活血化瘀，化痰祛風”，治療AS 類疾病中取得了較好效果，為補氣、活血、祛風、化痰類中成藥改善血脂代謝及防治AS提供了策略［5］。本研究旨在探討蛭龍活血通瘀膠囊對高脂血癥頸動脈粥樣硬化家兔血脂的影響及該藥物改善頸動脈病變組織p-NF-κB及NLRP3的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物清潔級新西蘭大白兔40 只，雌雄各半，體質量（2.0±0.4）kg，由西南醫(yī)科大學實驗動物中心提供，實驗動物許可證號：SYXK（川）2018-065。飼養(yǎng)于西南醫(yī)科大學動物實驗中心，光照每日12 h，室溫19～22℃，濕度40～60%飼養(yǎng)。實驗方案通過西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)院動物倫理委員會審查。

1.2 藥品與試劑基礎飼料由西南醫(yī)科大學動物實驗中心提供，高脂飼料配方（以下均為質量分數(shù)）：96%的普通飼料、2%的膽固醇、2%的豬油。蛭龍活血通瘀膠囊（西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)院制劑室提供，批準文號：川藥字Z20070528，規(guī)格：0.4 g×48 粒/瓶）；阿托伐他汀（北京嘉林藥業(yè)有限公司，國藥準字H20093819，規(guī)格：20 mg×7片/盒）；麗春紅、吐溫20、丙烯酰胺及BCA 蛋白濃度測定試劑盒、蛋白裂解液（RIPA）購自碧云天生物技術研究所；Tris-Hcl、NaCl 購自生工生物工程股份有限公司；0.45 μm PVDF 膜（Millipore，Schwalbach，Germany）、anti-p-NF-κB（貨號：stj28018）購自英國St John′s Laboratory；anti-NF-κB（貨 號：arp38197_p050）、anti-NLRP3 antibody（貨號：arp63297_p050）購自美國Aviva Systems Biology公司。

1.3 實驗儀器BS224 型電子天平（北京塞多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；78-1 型磁力攪拌器（常州國華電器有限公司）；3K15 型低溫高速離心機（Sigma公司）；冷凍離心機（HettichMikro 200R）；Berthold LB941微孔板式多功能酶標儀（Berthold公司）；MINI-PTET 型Western blotting 系統(tǒng)型號；COMP SYS；10 W；1.0 MM、POWERPAC HC POWER SUPPLY、SEMI DRY BLOT APPARATUS（Bio-Rad 公司）；Tanon 6600發(fā)光成像工作站（Tanon公司）。

1.4 造模方法參考武曉玲等［6］報道的使用高脂飼料加空氣干燥術建立頸動脈粥樣硬化動物模型。實驗動物術前禁食12 h，不禁水，經(jīng)麻醉、頸部脫毛清潔消毒后，作頸部正中切皮，于甲狀軟骨上方水平分離左側頸總動脈，長約2.5 cm。血管兩端以動脈夾阻斷血流，使用4.5 號頭皮針于血管縱軸方向穿刺進入阻斷血管兩端，用生理鹽水沖洗置換出管腔內血液，接流量為250 mL/min 的氣流干燥內皮5 min，然后將夾閉的頸動脈內重新充滿生理鹽水并取下動脈夾使頸動脈恢復血供。濕潤棉片輕輕壓迫穿刺點2～3 min止血。縫合皮膚創(chuàng)口并包扎。術后肌肉注射慶大霉素預防感染，繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)4 周建立兔頸動脈粥樣硬化模型。

1.5 分組給藥方法家兔用普通飼料適應性喂養(yǎng)1 周，按隨機數(shù)字表法分為正常組、模型組、蛭龍活血通瘀膠囊組、阿托伐他汀組、蛭龍活血通瘀膠囊+阿托伐他汀組。除正常組繼續(xù)基礎飼料喂養(yǎng)，其余各組均高脂飼料喂養(yǎng)外，手術后繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)4 周。單籠喂飼，飲水不限，每日每只進食150 g 飼料。蛭龍活血通瘀膠囊成人用量每日4.8 g，體質量按60 kg 計算，換算為動物高劑量為含生藥3.12 g/（kg·d），為成人用量6 倍。阿托伐他汀組0.51 mg/（kg·d），為臨床成人用量3 倍。灌胃體積均為4 mL/kg［7］。

1.6 樣品采集與血脂測定第4 周末動物禁食不禁水12 h，采用空氣注射法處死家兔，股動脈采血。血樣室溫自然凝固，4℃、離心半徑8 cm，3000 r/min 離心10 min，分離血清。采用全自動生化儀檢測血清膽固醇（cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）以及LDL-C 水平；沿前期頸部造模處位置做一正中切口，暴露頸總動脈，分離動脈鞘及周邊組織，截取造模處頸動脈組織約2 cm備用。

1.7 頸動脈組織總蛋白提取和免疫印跡分析稱取頸動脈組織約50 mg，用干凈的剪刀將組織塊剪碎；加400μL RIPA 裂解液于勻漿器中進行勻漿，離心半徑8 cm，12 000 r/min 離心5 min，吸取上清，BCA 定量。SDS-PAGE 電泳分離蛋白，采用濕轉方法將蛋白轉至PVDF 膜上。5%脫脂奶粉封閉1 h，孵育相應的一抗，4℃過夜，用TBST 洗膜3 次，每次10 min。然后將膜置于封閉袋中，加入適量適當濃度的二抗，封閉袋口，室溫下孵育1 h。剪開自封袋，用TBST洗膜3次，每次10 min。等體積混合化學發(fā)光試劑A液和B液，將膜蛋白面向下與此混合液充分接觸；5 min 后用Tanon 6600 發(fā)光成像工作站進行檢測，并使用Image Pro Plus 6.0 軟件分析光密度值，檢測p-NF-κB、NF-κB、NLRP3蛋白質表達水平。

1.8 HE 染色分離1 cm 長的頸動脈組織，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋并制成4 μm 石蠟切片，石蠟切片脫蠟至水，切片入蘇木素染液染后，沖洗分化反藍，經(jīng)伊紅染色后脫水封片。400 倍光鏡下觀察組織情況。

1.9 統(tǒng)計學方法應用GraphPad Prism 8.0 軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以±s表示，采用單因素方差分析，組間多重比較方差齊采用LSD-t檢驗，方差不齊采用Dunnett’s T3 檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般狀況家兔一般狀況良好，實驗過程中各組家兔未出現(xiàn)厭食、消瘦、明顯不能耐受藥物等副作用表現(xiàn)及突發(fā)的急性死亡。各組家兔體質量呈生理性增長，在第0、2、4 周組間比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組家兔不同時間體質量比較（±s） kg

表1 各組家兔不同時間體質量比較（±s） kg

2.2 血脂水平與正常組比較，模型組TC、TG、HDL-C、LDL-C 水平均升高（P＜0.01），提示高脂血癥模型造模成功；各用藥組HDL-C 均有所升高，但組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與模型組比較，各給藥組TC、TG、LDL-C 水平均不同程度降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；各給藥組TC、TG 水平下降（P＜0.01），阿托伐他汀組及蛭龍活血通瘀膠囊+阿托伐他汀組LDL-C降低（P＜0.01），蛭龍活血通瘀膠囊可一定程度上降低LDL-C，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與阿托伐他汀組相比，蛭龍活血通瘀膠囊+阿托伐他汀組降低TC的效果更明顯（P＜0.01），蛭龍活血通瘀膠囊組及蛭龍活血通瘀膠囊+阿托伐他汀降低LDL-C 的作用較阿托伐他汀組更強（P＜0.05）；各給藥組及模型組間HDL-C 比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組家兔血脂水平比較（±s） mmol/L

表2 各組家兔血脂水平比較（±s） mmol/L

注：與正常組比較，##表示P＜0.01；與模型組比較，**表示P＜0.01；*表示P＜0.05；與阿托伐他汀組比較，▲▲表示P＜0.01，▲表示P＜0.05

2.3 頸動脈組織p-NF-κB、NLRP3 蛋白表達與模型組相比，蛭龍活血通瘀膠囊組、阿托伐他汀組和蛭龍活血通瘀膠囊+阿托伐他汀組p-NF-κB、NLRP3水平均下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與蛭龍活血通瘀膠囊+阿托伐他汀組比較，蛭龍活血通瘀膠囊組p-NF-κB、NLRP3 水平升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），阿托伐他汀組p-NF-κB 水平高于蛭龍活血通瘀膠囊+阿托伐他汀組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 頸動脈組織p-NF-κB、NLRP3蛋白表達

2.4 頸動脈形態(tài)學改變藥物干預4 周后，光鏡下正常組家兔頸動脈內皮完整，分界較清晰，內膜光滑，平滑肌細胞完整，排列整齊；模型組頸動脈內大量脂質沉積并有向管腔內凸起的斑塊，中膜內層出現(xiàn)斷裂，平滑肌細胞顯著增生，可見由大量泡沫細胞構成的脂質斑塊，斑塊內有炎癥細胞浸潤并有變性壞死；治療后蛭龍活血通瘀膠囊組，阿托伐他汀組和蛭龍活血通瘀膠囊+阿托伐他汀組炎癥細胞減少，內皮細胞增生腫脹并有脂肪細胞浸潤，中膜平滑肌細胞腫大增生、排列紊亂頸動脈內膜有粥樣斑塊沉積，其中蛭龍活血通瘀膠囊+阿托伐他汀組內皮細胞下有脂質沉積，其形態(tài)學變化接近于正常組。見圖2。

圖2 各組家兔頸動脈病理變化（HE，×400）

3 討論

本研究結果顯示，蛭龍活血通瘀膠囊可以降低高脂血癥頸動脈粥樣硬化家兔TC、TG，降低頸動脈病變組織NF-κB 的磷酸化及NLRP3 蛋白的表達。蛭龍活血通瘀膠囊是楊思進教授在多年臨床經(jīng)驗的基礎上開發(fā)的中藥復方制劑，由黃芪、桂枝、大血藤、水蛭、地龍等藥組成。該中藥復方制劑在治療腦卒中、冠心病、血栓性疾病等方面臨床反饋較好［5-7］。在蛭龍活血通瘀膠囊的前期研究中吳英等［8］證實該藥物可降低高脂血癥大鼠血脂水平。楊思進等［9］在實驗中發(fā)現(xiàn)蛭龍活血通瘀膠囊可以降低家兔預動脈NF-κB、ICAM-1 表達，改善高血壓頸動脈粥樣硬化模型家兔頸動脈AS 病變。前期研究與本研究結果一致，表明蛭龍活血通瘀膠囊抗AS作用確切。

高脂血癥被認為是AS 發(fā)生的主要危險因素，脂質浸潤學說認為基于脂質沉積而形成的斑塊是由于血液中脂質水平過高從而滲透至血管內膜造成，且有研究報道AS 的發(fā)生與TC 升高呈正相關［4］。AS 形成需要NLRP3 炎性小體的活化參與，膽固醇晶體通過激活NLRP3 炎性小體，促進血管內皮細胞焦亡，進而導致內皮功能障礙誘導AS 的發(fā)生［10-11］。NLRP3 炎癥小體的活化需要啟動和激活雙重信號調控，NF-κB 介導了啟動過程，磷酸化的NF-κB可上調NLRP3等相關炎性因子前體表達，因此p-NF-κB 為NLRP3 活化提供物質基礎［12］。通過抑制p-NF-κB 降低NLRP3 及相關炎性因子前體的表達從而抑制NLRP3炎癥小體的激活［13-14］。

本研究采用高脂飼料加空氣干燥術建立頸動脈粥樣硬化動物模型［9］。該造模方法成熟，成功率高，易于復制，可在較短時間誘發(fā)兔頸動脈粥樣硬化并形成斑塊。阿托伐他汀是目前臨床常用的降血脂藥物，故本實驗將其選為對照藥物［15-16］。實驗結果顯示蛭龍活血通瘀膠囊可以降低高脂血癥頸動脈粥樣硬化家兔TC、TG，抑制頸動脈病變組織p-NF-κB、NLRP3 表達，可以通過抑制平滑肌細胞增殖、抗血栓及對抗脂質浸潤的作用來抑制高脂血癥動脈粥樣硬化動物模型頸動脈斑塊的形成，且蛭龍活血通瘀膠囊與阿托伐他汀聯(lián)合可提高療效。因此，蛭龍活血通瘀膠囊發(fā)揮抗AS 的作用機制可能是通過改善血脂、抑制NF-κB 的磷酸化及NLRP3 的表達實現(xiàn)，但其確切機制尚待進一步深入研究。