間質干細胞在寵物臨床應用的研究進展

楊嘉麗 ， 關鈺澄 ， 張詩薇 ， 劉亞駒 ， 李少川 ， 石達友

(華南農業大學獸醫學院 ， 廣東 廣州 510642)

據2016年底統計，美國有大約57%的家庭養寵物，犬貓是最受歡迎的飼養選擇。寵物疾病的相關癥狀、自然病史、病理學、環境危險因素以及對藥物的反應在一定程度上類似于人類的疾病，基因相關性比嚙齒類動物更敏感[1-2]。當前寵物間質干細胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)療法主要臨床應用研究包括關節疾病、神經肌肉疾病、皮膚疾病、炎癥性腸病(Inflammatory bowel disease，IBD)、干燥性角膜結膜炎(Keratoconjunctivitis sicca，KCS)、肛周瘺、心肌病、慢性腎病(Chronic kidney disease，CKD)、腦膜炎等，試驗動物主要為犬。

干細胞是一類具有不同程度自我更新和分化潛能的細胞。根據發育階段，可分為胚胎干細胞(Embryonic stem cells，ESCs)和成體干細胞(Adult stem cells，ASCs)。ESCs的臨床應用受到倫理道德的限制，目前普遍使用的MSCs是ASCs的一種。MSCs具有低免疫原性，成瘤性爭議低。MSCs來源豐富，骨髓來源間質干細胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BM-MSCs)含量最多，脂肪來源間質干細胞(Adipose-derived mesenchymal stem cells，AD-MSCs)取材方便，因而兩者被研究得最多。MSCs在不同組織中含量、增殖能力、免疫調節能力不同，動物年齡和獲取位置也與性能相關。國際細胞療法協會(International Society for Cellular Therapy，ISCT) 在2006年提出了MSCs的鑒定標準：在標準培養條件下具有貼壁性；表達特異性表面抗原，高表達(≥95%)CD105、CD73、CD90，低表達(≤2%)CD45、CD34、CD14或者CD11b、CD79α或者CD19、HLA-DR；在體外具有多分化潛能，可分化為骨細胞、脂肪細胞以及軟骨細胞[3]。目前研究發現的MSCs作用機制包括多向分化潛能、生物活性物質、免疫調節作用、細胞間物質傳輸和表觀遺傳學調控[4]。

1 間質干細胞在寵物的臨床應用

1.1 關節疾病

1.1.1 關節炎 退行性關節疾病(Degenerative joint disease，DJD)也稱骨關節炎(Osteoarthritis，OA)，是一種由于關節軟骨損傷、關節周圍出現退行性和增生改變的慢性進程性關節疾病。滕鑫[5]發現，直接移植犬原代 AD-MSCs 到關節腔進行修復軟骨組織缺損具有可行性。Vilar等[6-7]關節內注射AD-MSCs治療犬嚴重髖關節疾病，臨床癥狀改善且認為最大效果的維持時間少于3個月。張貝瑩等[8]認為，臍帶血間質干細胞(Umbilical cord blood mesenchymal stem cells，UCB-MSCs)能明顯抑制關節損傷導致的炎癥反應。Cuervo等[9]表示，單獨使用AD-MSCs治療犬髖關節炎，在6個月的時候比單獨使用富含生長因子的血小板(Platelet rich in growth factor，PRGF)的作用更好。

1.1.2 股骨壞死 無菌性股骨壞死又稱累卡佩氏病，通常是因髖關節發育不良造成的股骨缺血性壞死，多發于小型犬。林飛太等[10]認為，多孔陶瓷支架是良好的組織工程支架材料，結構與自然骨接近，聯合自體BM-MSCs移植更能有助骨修復，具有更好的抗壓強度。

1.2 神經肌肉疾病

1.2.1 脊髓損傷 椎間盤疾病(Intervertebral disc disease，IVDD)是犬常見的退行性脊髓疾病，MRI是診斷IVDD的重要診斷工具，在發展為礦化病變前，可檢查早期的退行性病變，優于CT和X線。Hiyama A等[11]探討自體AD-MSCs移植量對IVDD的療效影響，發現106MSCs移植量的狀態下，髓核細胞存活率高，細胞外基質和微結構環境是最好的。Bhat等[12]把44例犬脊髓損傷臨床病例分為傳統治療組和傳統藥物結合異體BM-MSCs治療組，結果顯示，結合BM-MSCs治療組的神經學檢查綜合評分最高。但是多數試驗結果顯示，椎間盤MRI成像沒有明顯差異。

1.2.2 神經損傷 神經損傷的自我修復能力往往有限，因MSCs具有多分化潛能的優點，為神經修復帶來良好前景。劉玉梅等[13]通過MTT 法篩選褪黑激素(Melatonin，MT)促AD-MSCs增殖至最佳濃度，結果顯示，50 nmol/L MT聯合AD-MSCs治療組的犬脊髓神經參數良好，表明MT預處理AD-MSCs顯著提高了犬坐骨神經損傷的修復效果。

1.3 皮膚疾病 意外創傷、部分內分泌疾病和免疫系統疾病造成的皮膚損傷難以愈合，而免疫抑制藥物存在不良反應的風險，干細胞或許是新的治療方法。犬臨床研究表明，MSCs具有促進皮創傷愈合的趨勢，可減少炎癥反應，增強mRNA表達，促進細胞增殖和血管形成[14-16]。Nam等[17]通過靜脈和肝實質注射AD-MSCs治療1例犬肝病導致的淺表性壞死性皮炎，治療初期整體狀態改善，皮膚病灶縮小甚至消失，但后來由于肝病進展性惡化，患犬死亡。Han等[18]對1例類固醇難治性落葉型天胞瘡使用AD-MSCs進行治療，發現皮膚改善，潑尼松龍使用劑量減少。

1.4 炎癥性腸病 炎癥性腸病(Inflammatory bowel disease, IBD)一般是通過排除法診斷，是犬貓常見疾病，易復發，需要長期的藥物治療和飲食調理。Pérez-Merino等[19-20]對靜脈給予同源異體AD-MSCs治療犬IBD進行研究，結果表明，組織學病變得到改善，臨床評分除了C-反應蛋白沒有下降，其他評分均有所改善。Webb等[21]對慢性腸下垂超過3個月的貓進行同源異體AD-MSCs治療研究，試驗組臨床得分改善，71%貓臨床癥狀明顯改善甚至消失。不過，該研究缺乏白蛋白、維生素B12、葉酸試驗數據。盡管如此，MSCs對腸道絨毛的再生有著顯著作用，有助腸道修復。

1.5 干燥性角膜結膜炎 干燥性角膜結膜炎(Keratoconjunctivitis sicca, KCS)又稱干眼癥，是淚腺功能異常導致淚液分泌失衡的疾病。常用治療藥物為抗生素、人工淚液和免疫抑制藥物，但容易反復發作，且部分藥物昂貴，MSCs或許可以成為替代治療。Villatoro等[22]探究對KCS犬第三眼瞼淚腺附近和圍繞第三眼瞼腺體注射不同劑量同源異體AD-MSCs的療效，結果顯示，所有測定結果均改善，病程沒有惡化。Bittencourt等[23]在主淚腺和第三眼瞼腺體注射同源異體AD-MSCs治療犬KCS，研究結果顯示，MSCs比免疫抑制藥物的治療效果好，有效持續時間長。

1.6 肛周瘺 犬肛周瘺是肛周組織發生潰瘍和成瘺的疾病，高發于德國牧羊犬[24]，可能與其大汗腺數量多有關，偶爾和IBD并發。犬肛周瘺類似于人類克羅恩氏病，免疫抑制藥物和支持療法是主要治療手段，但是復發率高。Ferrer等[25]評估人胚胎干細胞源性間質干細胞(Human embryonic stem cell derived mesenchymal stem cells，hESC-MSCs)治療犬肛周瘺的療效，結果顯示，犬IL-2和IL-6水平下降，3個月后所有犬的肛周瘺均完全閉合，但其中2只犬復發，表明hESC-MSCs具有治療潛能，安全性良好。

1.7 心肌疾病

1.7.1 犬擴張型心肌病 犬擴張型心肌病(Dilated cardiomyopathy，DCM)以心腔擴張和腔壁變薄為主要病變，導致心輸出量減少，容易誘發充血性心力衰竭，主要影響大型犬，杜賓犬是高發品種。Pogue等[26]采用酪氨酸突變重組腺相關病毒2-基質細胞來源因子-1轉導AD-MSCs，行冠狀靜脈注射治療杜賓犬擴張型心肌病，除了1只犬在注射24 h后出現心室纖維性顫抖死亡外，其余犬只在隨后2年研究期間沒有出現并發癥，平均存活時間為620 d。

1.7.2 心肌梗死 心肌梗死是因冠狀動脈閉塞導致以缺血性心肌壞死為主的疾病。楊亞等[27]進行多功能心腔內導管移植 BM-MSCs治療犬心肌梗死，可促進血管再生，減少非梗死區膠原沉積。近年研究[28-29]表明，超聲介導微泡破壞聯合BM-MSCs能促進歸巢，使心肌梗死面積縮小，改善心功能。

1.8 慢性腎病 慢性腎病(Chronic kidney disease, CKD)是貓常見疾病，多數貓CKD的進程不可逆轉，一旦發生很難根治。Quimby等[30-31]發現，冷藏保存脂肪組織分離的AD-MSCs安全性比冷藏保存的AD-MSC更高，且注射劑量應謹慎。一項對貓CKD自體AD-MSCs靜脈注射治療的40例臨床案例回顧表明，MSCs療法風險低，長達330 d的隨訪沒有出現不良反應[32]。

1.9 腦膜腦炎 腦膜腦炎是犬貓常見的顱部疾病，根據其病變區域而表現不同的神經癥狀。Zeira 等[33]評估BM-MSCs治療類固醇難治性犬未明原因的腦膜腦脊髓炎 (Meningoencephalomyelitis of unknown origin，MUO)的安全性和療效，結果顯示，對MUO的犬靜脈、動脈、鞘內注射自體BM-MSCs均安全，沒有出現不良反應，且鞘內和動脈內注射比鞘內和靜脈內注射反應時間更快。患犬神經學檢查結果改善，部分犬的MRI圖像顯示，經治療后沒有明顯差異。

2 展望

目前，寵物干細胞臨床研究興起，再生醫學療法對于寵物關節疾病、神經肌肉疾病、皮膚疾病的療效得到越來越多肯定。干細胞越來越多的被用于傳統無法治療的疾病，或許可以提供一個治療的新方向。但各臨床研究的MSCs治療方案不一致，難以進行客觀分析。未來需要優化方案，這涉及采集和培養的技術，增強MSCs歸巢和旁分泌能力，抑制細胞凋亡進程。干細胞的成瘤性、生產技術、長期安全性等問題還有待解決，需要多學科領域共同努力。