微生物合成植物天然產物的細胞工廠設計與構建

孫文濤，李春

（清華大學化學工程系，北京100084）

植物天然產物通常指來源于植物的一類功能性次級代謝產物，主要包括萜烯類、黃酮類以及生物堿等，這些化合物雖然不是植物生存的必須物質，但它們的存在賦予了植物抵抗病蟲害以及除草劑等異型生物質（xenobiotic）的潛能，從而提高了植物適應環境和生存的能力[1]。植物天然產物作為藥物及藥物分子設計靈感的來源，也是新型藥物開發的重要資源，這些化合物均在活體植物細胞中積累，意味著其具有低細胞毒性的特性[2]。自公元前2600 年，人類已經開始將植物作為藥物使用，迄今為止，來源于植物天然產物的藥物占據了全部藥物種類的近四分之一，隨著傳統藥物和植物化學研究的發展，越來越多天然產物的功能得以鑒定，并已應用于營養食品和藥物制造等領域[3]。

然而，植物天然產物的生產能力嚴重限制了其研究和應用。由于大多數植物天然產物只能從植物中提取，而且這些化合物僅存在于特定的植物器官中，如甘草酸和紫杉醇分別在甘草的根和紅豆杉的樹皮中積累[4]，因此植物提取法不但消耗大量的植物資源，并且生產過程中大量酸堿及有機溶劑的使用會造成嚴重的環境污染及生態破壞，無節制地大規模生產甚至會導致物種滅絕。此外，天然產物在植物體內積累緩慢，且積累量低，人工種植的方式也會面臨栽培周期長、大量占用耕地、受氣候條件威脅等問題。同時植物中多種結構類似物的存在也使分離過程更加困難，進一步增加了成本[5]。這就導致依靠傳統植物提取的生產方式難以滿足研究和市場需求，因此需要一種更加綠色高效的方法來合成植物天然產物[6]。對此研究人員通過品種選育來提高天然產物在植株中的含量，但是無法解決占用耕地以及氣候、病蟲害的威脅等問題。利用生長快、易栽培的模式宿主如擬南芥對植物天然產物進行異源合成也可用以提高植物天然產物的生產能力，但是植物編輯的困難性限制了這種方法的應用。通過植物細胞和組織培養可以可持續地獲得植物天然產物，然而由于該方法的高成本、植物細胞系難以建立、產物積累量低等問題使其難以大規模生產，僅能用于紫杉醇等少數高價值化合物的合成[7]。

利用化學法從頭合成植物天然產物同樣具有挑戰性，植物天然產物復雜的分子結構使得其合成過程涉及多步反應。一般情況下，一個復雜分子的合成途徑如果超過10 步，那么這種方法便幾乎不具備實用性，因為每一步反應都會降低回收率并造成資源浪費。盡管化學合成有成功的案例，但由于其產率極低，如利用化學法從頭合成紫杉醇的產率僅為0.02%[9]，因此化學法對于結構復雜的天然產物合成的實際應用價值非常有限。

由于微生物生長迅速，可利用可再生資源對植物天然產物進行異源合成，因此微生物細胞工廠已成為解決當前問題的一種選擇。經過理性設計的工程菌株能合成單一目標產物，減少了多種結構類似物的合成，可以避免植物提取過程中多種結構類似物導致目標產物分離純化困難的問題，同時能夠減少有機溶劑的使用，降低純化過程對環境的污染。此外，微生物發酵過程安全可控，不占用耕地，降低了氣候變化對生產的影響，可實現目標產物的持續供應[10-11]。

近年來，隨著測序技術的快速發展，許多植物天然產物的合成途徑已被解析，極大促進了利用微生物異源合成天然產物的研究，可發酵微生物如大腸桿菌以及釀酒酵母已經被廣泛地應用于植物天然產物的異源合成，并且已經開始形成商業化規模，如青蒿酸的生產。美國加州大學伯克利分校Keasling 課題組[12]將不同來源的多個基因在酵母中組裝，構建了合成青蒿素前體青蒿酸的工程菌株，最高產量達到25g/L，100m3發酵產量可替代5萬畝黃花蒿的種植，堪稱合成生物學重大突破的典范。

目前已實現多種萜烯類、黃酮類和生物堿等植物天然產物在大腸桿菌、酵母等宿主中的合成，包括紫杉二烯、那可丁、甜菊苷和氫可酮等。近年來我國在番茄紅素、甘草次酸、4-羥基香豆素、人參皂甙和丹參酮二烯等微生物合成方面都取得了重要進展。然而，由于大部分植物天然產物合成途徑長、關鍵酶催化效率低、與微生物宿主適配性差等問題，導致產量低，限制了其產業化。通常來講，優化酶的活性和代謝效率是植物天然產物異源合成中面臨的主要挑戰。為解決這些問題，研究人員開發了一系列的合成生物學方法及代謝工程策略，用于在微生物細胞中高效合成植物天然產物的研究。

1 天然產物的生物合成途徑

1.1 萜烯類化合物的生物合成途徑

萜烯化合物的合成源自五碳單元異戊二烯焦磷酸（IPP）和焦磷酸二甲基烯丙酯（DMAPP），IPP可在異戊烯基焦磷酸異構酶（IDI）作用下發生可逆的異構化作用生成DMAPP。在植物細胞中，IPP和DMAPP 可分別由甲羥戊酸（MVA）途徑以及2-甲基-D-赤蘚醇-4-磷酸（MEP）途徑兩種途徑產生。MVA 途徑主要存在于植物、酵母、動物、古生菌以及一些革蘭氏陽性菌中，主要定位于細胞質和內質網，其合成起始于乙酰輔酶A。MEP途徑則位于植物質體中，除此之外也存在于革蘭氏陰性菌、藍細菌以及綠藻中。MEP 途徑利用3-磷酸甘油醛合成中間產物MEP 再經連續多步反應合成IPP。 IPP 和DMAPP 進一步縮合形成單萜（monoterpenoid）前體牻牛兒基焦磷酸（GPP）、倍半萜（sesquiterpenoid）前體及三萜（triterpenoid）前體法尼烯焦磷酸（FPP）、二萜（diterpenoid）及四萜（tetraterpenoid）前體牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸（GGPP）等（圖1）。這些前體物質經過萜烯合酶首先合成萜烯分子骨架，如倍半萜骨架青蒿酸（artemisinic acid）、三萜骨架β-香樹脂醇（β-amyrin），分子骨架經過P450 氧化酶作用引入羥基等活性基團，同時改變了其理化性質并增加其化學多樣性。在植物中，三萜化合物通常以皂甙的方式存在，經P450 氧化酶修飾過的萜烯分子骨架在UDP-糖基轉移酶（UGT）的作用下通過活性基團在骨架上引入多種糖基，進一步改變了其理化性質如增加溶解度、甜度等，同時也進一步增加其化學多樣性[6]。

1.2 黃酮類化合物的生物合成途徑

黃酮類化合物的合成途徑位于植物細胞內質網的胞質一側，其前體多為柚皮素（naringenin）或松屬素（pinocembrin）。柚皮素由酪氨酸的代謝產物與丙二酰輔酶A縮合產生，松屬素則由苯丙氨酸的代謝產物與丙二酰輔酶A縮合產生。酪氨酸在酪氨酸胺裂解酶（TAL）的作用下脫氨基形成對香豆酸，而苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶（PAL）的催化下脫氨基合成肉桂酸。對香豆酸和肉桂酸可在4-香豆酰輔酶A連接酶（4CL）的催化下合成4-香豆酰輔酶A （p-coumaroyl-CoA） 或 者 肉 桂 酰 輔 酶A（cinnamoyl-CoA），這兩種物質分別與丙二酰輔酶A在查耳酮合酶（CHS）作用下合成柚皮素查耳酮（naringenin chalcone） 或 者 松 屬 素 查 耳 酮（pinocembrin chalcone），隨后在查耳酮異構酶（CHI）作用下合成黃酮前體柚皮素和松屬素。同時，肉桂酸也可在肉桂酸羥化酶（C4H）作用下形成香豆酸，進而參與柚皮素的合成（圖2）。

圖1 萜烯化合物合成途徑

圖2 植物黃酮類化合物合成途徑

作為黃酮的直接前體，柚皮素和松屬素在合成黃酮化合物的過程中需經過羥基化、甲基化、糖基化等多種修飾。羥基化是植物黃酮的一種重要修飾形式，主要由P450 氧化酶催化。活性基團羥基的引入增加了黃酮分子的反應性，對于黃酮分子的進一步修飾增加其分子多樣性具有重要意義。甲基化是植物次級代謝產物的一種常見的修飾手段，黃酮在植物體內通常被SAM 依賴的氧甲基轉移酶[S-adenosyl-L-methionine (SAM) -dependent caffeoyl-CoA O-methyltransferases(OMTs)]甲基化，同時也有研究表明，來自微生物的SAM依賴的OMTs 也可對植物黃酮進行甲基化[4]。與三萜化合物類似，植物中黃酮類化合物多以糖基化形式進行存儲，在UGT 催化下，在其羥基等活性基團上引入糖基，進一步增加了其化學多樣性而且改變了其生理生化性質[4,13]。

1.3 生物堿的生物合成途徑

生物堿是一類含有氮原子的天然產物，不同于萜烯以及黃酮類化合物，生物堿具有更加多樣化的合成途徑，其合成可以來源于不同的代謝前體物[14]。在種類眾多的生物堿化合物中，由于生理活性以及分子結構的多樣性，芐基異喹啉生物堿（BIA）以及單萜吲哚生物堿（MIA）是特別值得關注的兩類生物堿[15-16]。

芐基異喹啉生物堿的合成起源于合成自莽草酸途徑的芳香族氨基酸，如圖3。在莽草酸途徑中，其第一步反應3-脫氧-D-阿拉伯庚糖酮酸-7-磷酸（DAHP）合酶催化赤蘚糖-4-磷酸與磷酸烯醇式丙酮酸立體特異性地縮合形成DAHP，用于合成莽草酸。由莽草酸作為前體進一步合成芳香族氨基酸苯丙氨酸和酪氨酸。酪氨酸的代謝產物多巴胺和4-羥基苯乙醛經去甲烏藥堿合酶（NCS）作用合成去甲烏藥堿（norcoclaurine），進入芐基異喹啉合成途徑。在該過程中，酪氨酸在酪氨酸脫羧酶（TYDC）作用下發生脫羧反應合成色胺或在P450 氧化酶CYP76AD1 作用下羥化合成L-多巴（L-DOPA），色胺和L-多巴分別在色胺羥化酶（tyramine 3-hydroxylase）和DOPA 脫羧酶（DODC）作用下合成多巴胺，同時酪氨酸在酪氨酸轉氨酶（TyrAT）作用下形成4-羥基酚基丙酮酸，進一步通過4-羥基苯丙酮酸脫羧酶（4-HPPDC）作用合成4-羥基苯乙醛，4-羥基苯乙醛與多巴胺在去甲烏藥堿合酶作用下合成去甲烏藥堿。去甲烏藥堿經過后續的甲基轉移酶、P450 氧化酶等修飾合成(S)-牛心果堿成為BIA 的核心分子骨架，用于合成各種特異的生物堿，比如(S)-牛心果堿在一個P450氧化酶和酮醛還原酶構成的融合蛋白（STORR）催化下合成(R)-牛心果堿，進而合成嗎啡、蒂巴因、可待因等。

所有單萜生物堿的合成都來自色氨酸以及馬錢子苷，其復雜的合成過程需要多種酶的參與，涉及色氨酸脫羧酶、馬錢子苷合酶以及異胡豆苷合酶等關鍵酶[14]。如圖4所示，由萜烯前體牦牛兒基焦磷酸合成的單萜化合物香葉醇經香葉醇10-氧化酶（G10O）及10-羥基香葉醇氧化還原酶（10-HGO）修飾形成10-氧香葉醇，10-氧香葉醇經過連續的氧化還原及糖基化反應形成馬錢子苷，馬錢子苷在一種NADPH 依賴的P450 氧化酶-斷馬錢子苷合酶（SLS）的催化下合成斷馬錢子苷。與此同時，色氨酸在吡哆醛依賴的色氨酸脫羧酶（TDC）作用下脫羧形成色胺，色胺與馬錢子苷由異胡豆苷合酶（STR）縮合生成單萜吲哚類生物堿的分子骨架異胡豆苷，再經過P450 氧化酶、甲基轉移酶、酰基轉移酶等修飾進一步合成長春花堿、文都靈等單萜生物堿類化合物[17]。

圖3 芐基異喹啉生物堿合成途徑

在這些天然產物的合成過程中，細胞色素P450 氧化酶是涉及最為廣泛的一種酶，參與了大多數C—H活化引入羥基等活性基團的過程，同時P450 氧化酶還參與了在骨架修飾過程中的開環、環氧化等重要反應過程，由于植物P450 氧化酶為膜蛋白且在微生物中表現出雜泛的催化活性，因此P450 氧化酶催化的反應通常為天然產物合成過程中的限速步驟。

2 植物天然產物合成途徑解析及在微生物中的重構策略

測序技術的快速發展促進了植物基因組與轉錄組的解析，通過功能基因組學策略使得多種天然產物的合成途徑得以闡明。通過對能夠合成以及不能合成特定化合物的植物轉錄組樣本進行比較，可以在能夠產生某種目標產物的植物樣本中獲得高表達或者特異性表達的一系列基因。以此為基礎通過分析其反應類型，進一步縮小篩選范圍，結合基因功能驗證可實現目標化合物的合成途徑的解析。在甘草次酸的合成過程中，由β-香樹脂醇到甘草次酸需要經過兩步氧化反應，通過對高產甘草酸以及不產甘草酸的甘草品種的轉錄組數據進行比較，Muranaka課題組[18-19]在高產甘草酸的植株中發現兩種高表達的P450氧化酶，CYP88D6以及CYP72A154。功能驗證表明，CYP88D6 和CYP72A154 分別可以氧化β-香樹脂醇的C-11 合成中間產物11-氧-β-香樹脂醇，以及進一步氧化11-氧-β-香樹脂醇的C-30 合成甘草次酸，從而完全解析了甘草次酸的生物合成途徑。為實現甘草次酸的異源合成，研究人員將這些來自于天然宿主的合成酶在微生物中進行異源表達從而重構了甘草次酸合成途徑，其產量約為15μg/L。張學禮課題組[20]通過植物懸浮細胞培養獲得與山楂葉本身相比，C-2a 羥化的三萜產物含量顯著提高的懸浮細胞。通過比較兩種樣本的基因轉錄差異，并對懸浮細胞中顯著高表達的P450氧化酶基因進行功能驗證，成功獲得一種多功能的P450氧化酶，實現了三萜C-2a氧化。利用該P450在酵母體內重構了C-2a 羥化三萜的合成途徑，實現了山楂酸、科羅索酸以及麥珠子酸的異源合成。懸浮細胞的應用不但解決了難以獲得具有顯著表型差異樣本的問題，由于其細胞分化程度低，也使得其轉錄組復雜程度低于植株本身，更利于分析。Hagel 等[21]通過對積累嗎啡以及不積累嗎啡但大量積累其前體蒂巴因的罌粟突變株進行差異轉錄組分析，確認了催化嗎啡合成下游途徑中的兩個關鍵酶，蒂巴因6-O-脫甲基酶和可待因6-O-脫甲基酶，從而解析了嗎啡合成的完整途徑。由于這些脫甲基反應是由一類獨特的2-氧化戊二酸/Fe(Ⅱ)依賴的雙加氧酶所催化，如果不是差異轉錄組分析的應用，這一類酶在篩選脫甲基酶的過程中很可能會由于無法進行準確的功能注釋而被忽視。此外，直接對轉錄組數據庫進行檢索，也是解析某些缺失反應步驟的有效方法。在植物研究中發現，可待因酮還原酶失活后會導致(S)-牛心果堿的積累[22]，研究人員假設可待因酮還原酶或其同源基因可能為催化(S)-牛心果堿下游反應的關鍵基因。基于該假設，Farrow 等[23]利用可待因酮還原酶基因對罌粟的轉錄組數據庫以及EST數據庫進行了檢索，發現了催化由(S)-牛心果堿合成(R)-牛心果堿的一種P450單加氧酶和類似可待因酮還原酶（COR）的醛酮還原酶的融合蛋白。但是這種方式成功與否取決于對于目標基因的假設是否正確。

圖4 單萜吲哚生物堿合成途徑

在已經鑒定的天然產物合成途徑中，有超過24種植物天然產物的生物合成途徑是以基因簇的形式存在的，因此利用基因簇對植物天然產物的合成途徑進行解析也是一種可行的方式。植物代謝的基因簇大小通常在幾十到幾百kb左右，包含3～10個基因，這些基因包含至少三步不同的生化反應并且編碼多種不同功能的酶[24]。例如，擬南芥中thalianol以及marneral 的合成途徑均以基因簇的形式存在，分別包含了四個和三個基因[25-26]。在卞基喹啉生物堿那可丁的生物合成途徑中，除cis-N-甲基轉移酶（TNMT）基因外，其他的全部基因在罌粟的基因組以一個10基因的基因簇的形式存在[27]。甜菜紅堿生物合成途徑中編碼前兩步反應的CYP76家族的P450氧化酶和L-DOPA-4,5-脫氧酶的編碼基因位于甜菜2號染色體的R基因座上50kb的范圍內，但是由于催化第三步反應的酶位于1號染色體，因此它也屬于一種部分基因簇的形式[28]。鑒于此，對基因組中的基因簇進行鑒定及功能驗證對于植物天然產物的途徑解析具有重要意義，基因簇鑒定工具plantiSMASH可以對植物天然產物合成的基因簇進行預測[29-30]。

通過進化分析也可以對植物天然產物的合成途徑進行預測，參與同一個生化過程的基因被認為會通過增加或消失的方式進行共進化。基于這個特性，多年來系統發育樹技術被用來從跨越多個種族的基因或蛋白的出現或消失矩陣中預測生物合成途徑。通過系統發育分析，研究人員發現一種特異性的N-甲基轉移酶基因家族擴張，從而極大地促進了咖啡因合成途徑的解析[24,31]。

依據天然產物合成途徑解析的結果，利用來源于天然宿主中的酶在微生物體內直接重構植物天然產物合成途徑，已經成為對其進行異源合成最常規、最直接的策略。但是這一策略也經常面臨某些步驟活性較差從而導致整體途徑活性差而產物產量低的現象，比如植物P450氧化酶催化的氧化反應。在利用釀酒酵母合成甘草次酸的研究中，由于CYP72A154 催化效率低，特異性差，導致甘草次酸產量僅有15μg/L。為提高甘草次酸合成效率，李春課題組[32]通過對豆科植物的轉錄組和基因組數據進行挖掘，獲得來源于苜蓿的CYP72A154 同源基因CYP72A63，具有更好的催化特異性及活性，并重構了甘草次酸合成途徑，使甘草次酸產量提高了近1000倍。

由于一些天然產物合成途徑并未完全解析，從而限制了這些化合物異源合成的研究。然而在自然界中，不同的植物或植株樣本間可能會具有相同或者類似的反應，因此這些缺失的步驟可以通過在其他植物中挖掘催化相同反應的酶來填補。隨著公開的酶學數據庫、基因組數據庫等的建立和不斷完善，極大地促進了跨宿主反應途徑的鑒定和解析。(S)-牛心果堿是芐基異喹啉生物堿合成的重要中間體，但是其前體多巴胺在植物中的生物合成途徑解析過程中遇到了困難。為實現多巴胺異源合成，研究人員利用來源于細菌的酪氨酸酶以及L-DOPA脫羧酶在大腸桿菌內重構了多巴胺合成途徑[33]，同時以來自于哺乳動物的酪氨酸羥化酶以及來自于細菌的DODC 在釀酒酵母中重構了多巴胺合成途徑[34]，實現了多巴胺的異源合成。不同來源的酶雖然可以催化同一個反應，但是催化機理可能完全不同，比如來源于哺乳動物的酪氨酸羥化酶需要四氫喋呤對作為電子載體，但是這種載體在微生物體內是不存在的，因此在微生物體內利用這一類酶時，需要同時設計一個四氫蝶呤的生物合成和循環途徑[35-36]。利用這些異源酶重構天然產物合成途徑時，由于其催化的雜泛性（指酶催化的區域選擇性、化學選擇性以及光學選擇性的非特異性）也會導致多種副產物的同時合成。比如酪氨酸酶具有非常廣泛的底物譜可以催化多種氧化反應，會導致DOPA-醌等副產物的產生。如圖5。

利用來源于不同宿主的酶重構特定天然產物的合成途徑，也為合成途徑的再設計提供了更多的可能，該過程中可以人為選擇不同的中間產物來實現多種天然或非天然目標產物的合成。在牛心果堿異源合成的研究中，研究人員通過單胺氧化酶將多巴胺轉化成3,4-DHPAA 來代替天然合成途徑中的4-DHPAA，多巴胺與3,4-DHPAA 縮合可形成非天然中間體全去甲勞丹堿[35]。利用非天然宿主來源的酶還有助于解決膜結合的酶在微生物體內尤其是原核生物中難以表達的問題。植物來源的肉桂酸4-羥化酶（C4H）作為一種膜結合的P450 氧化酶，難以在大腸桿菌體內進行功能性表達，而酵母PAL既可以作用于苯丙氨酸合成肉桂酸，也可催化酪氨酸合成對香豆酸，基于這一特性，利用酵母PAL可跳過肉桂酸羥化反應，直接通過酪氨酸合成對香豆酸，研究人員利用酵母PAL 在大腸桿菌體內成功重構了查耳酮合成途徑[37]。

圖5 植物天然產物合成途徑的重構策略

通過蛋白質工程使酶獲得新的催化特性也是解析天然產物合成途徑中缺失步驟的有效方法。通過依據晶體結構的理性設計或者隨機突變結合適當的篩選驗證策略，可解決天然合成途徑中催化特定步驟的酶由于缺乏遺傳等相關信息造成的難以獲得的問題，并且也是提高植物來源的酶在微生物中的活性，改善其催化特異性同時抑制副產物合成的有效策略。Dueber 等[38]通過一種植物多巴雙加氧酶將L-多巴轉化為帶有熒光的甜菜黃素，開發了一種基于熒光的高通量篩選方法，并利用其對CYP76AD1隨機突變庫進行篩選，獲得一個活性顯著提高的突變體，使工程酵母L-多巴產量提高了2.8倍。來自于黃花蒿的CYP71AV1催化紫蕙槐二烯到二氫青蒿酸的反應，但是其在大腸桿菌內的活性較低。研究人員通過基于ROSETTA 的能量最小化模型，對來自于巨大芽孢桿菌的P450BM3進行了理性設計，改變了其底物特異性，使其可以氧化紫蕙槐二烯，并利用其替換了CYP71AV1用于大腸桿菌中紫蕙槐二烯的氧化，顯著提高了反應效率[39-40]。李春課題組[41]利用同源建模和分子對接對催化雜泛性的CYP72A63進行改造，通過重塑其活性口袋以及調節活性口袋的疏水性，調控CYP72A63催化的區域選擇性以及化學選擇性，實現了11-氧-β-香樹脂醇C-30的特異性氧化，并利用其重構了甘草次酸合成途徑，利用釀酒酵母實現了甘草次酸的特異性合成。對于天然產物，尤其是反應過程復雜的生物堿的合成，由于缺乏遺傳和化學信息，某些生化過程仍未鑒定。針對這種情況，利用蛋白質工程對酶進行改造是一種行之有效的策略。

3 天然產物合成途徑強化策略

植物天然產物合成途徑的強化策略主要有：蛋白質工程、動態調控、代謝網絡再平衡、代謝途徑區室化，具體見圖6。

3.1 增強合成關鍵酶的活性

圖6 植物天然產物合成途徑的強化策略

植物來源的酶在微生物體內異源表達時，存在活性低、特異性差等問題，限制了天然產物的合成。因此提高限速酶的活性以及特異性，是促進代謝流更多地流向目標產物最直接的策略。對關鍵酶進行過表達可以促進其整體活性，例如，李春課題組[32]通過重構P450氧化系統以及增加β-香樹脂醇C-11氧化酶Uni25646的拷貝數，使11-氧-β-香樹脂醇的產量提高了近1422 倍，達到(108.1±4.6)mg/L。而蛋白質工程則可以從根本上提高酶的活性和選擇性，Deloache等[42]通過易錯PCR和DNA重排等技術獲得CYP76AD1突變體CYP76AD1（W13L/F309L），使多巴胺產量達到10.8mg/L，相比野生型提高了7.4倍。Xie等[43]利用番茄紅素帶有顏色的特性開發了一種基于菌落顏色的高通量篩選方法，用于一種八氫番茄紅素合酶CrtYB的定向進化，成功獲得催化特異性及活性均顯著提高的突變體CrtYB11M，結合代謝及發酵優化使番茄紅素在釀酒酵母中的產量達到1.6g/L。通過建立高通量的液相檢測方法，Wang 等[44]對UGTPg45 進行了定向進化提高其催化活性，最終使人參皂甙Rh2在釀酒酵母中的產量達到2.25g/L，為已報到最高水平。Edgar 等[45]通過對紫衫烯合酶以及CYP725A4進行理性設計，提高其合成taxa-4(20)-11(12)-diene 與taxadien-5α-ol的特異性，成功提高紫杉醇前體在大腸桿菌中的合成效率。Xiong 等[46]通過對CYP11B1 進行理性設計，成功提高了其合成21-脫氧皮質醇的特異性。與利用基因過表達強化代謝途徑相比，蛋白質工程具有不需要引入額外的代謝負擔、對菌體生長的擾動更小等優勢。然而對于一些難以結晶的蛋白，尤其是膜蛋白，由于缺乏晶體結構導致理性設計難以實現，對于這一類酶的改造通常基于半理性和隨機突變，因此開發相應的高通量篩選方法對于這一類酶的成功改造具有關鍵的作用。

P450 氧化酶是天然產物合成途徑中涉及最廣的一種酶，無論是萜烯化合物黃酮還是生物堿，羥基等活性基團的引入都需要P450 氧化酶的參與，因此P450 氧化酶的活性對天然產物異源合成具有重要作用。促進P450 氧化酶的正確折疊以及在微生物細胞內的穩定性是提高P450 氧化酶在微生物體內活性的常用方法。由于其N-端跨膜域對P450氧化酶的折疊具有重要影響，尤其是在沒有細胞器的原核生物中，對其N-端進行改造提高蛋白質的溶解性是保證P450 氧化酶活性所必需的過程。對于N-端的改造主要有直接截除和替換兩種方式。通過對8-杜松烯羥化酶的N-端跨膜域進行修飾并結合密碼子優化發現，氮端跨膜域直接截除或替換為來自于牛等物種的異源P450氧化酶的N-端跨膜序列均提高了其在大腸桿菌體內的催化活性，替換為牛來源的P450 的N-端序列構建的嵌合蛋白BovCAH，使8-羥基杜松烯在大腸桿菌中的產量達到100mg/L 以 上[47]。Biggs 等[48]通 過 將CYP725A4 的跨膜域替換為增溶序列來增加其可溶性，實現了其在大腸桿菌內的功能性表達，但是由于N-端跨膜域的改造影響酶與膜的相互作用，因此改造后酶的活性受到一定程度的抑制。N-端跨膜域的修飾除了影響酶的活性外，對其選擇性也有重要影響，對CYP11B1 的N-端跨膜域進行突變發現，該區域的突變會改變其氧化選擇性[49]。相比于原核生物，酵母具有完整的內膜結構，可以為膜蛋白的表達提供充足的空間和適宜的環境，因此植物來源的膜結合P450 氧化酶在酵母中表達具有先天的優勢。但是N-端跨膜域對其正確定位也可能產生影響。Galanie等[50]通過將一種P450氧化酶沙羅泰里啶合酶與不同來源的P450氧化酶的N-端跨膜域進行融合，獲得了能夠將(R)-牛心果堿到沙羅泰里啶的轉化效率提高6倍的融合蛋白。不同于在大腸桿菌內可以獲得一種通用的N-端標簽用于提高不同P450的活性[51]，在酵母中無法獲得通用的N-端標簽。因此，任意一個P450的N-端修飾都需要進行特異性篩選。

植物P450 氧化酶發揮功能需要P450 還原酶（CPR）為其提供電子，P450還原酶與P450氧化酶間的電子傳遞效率顯著影響P450 的活性[52-53]。將P450 氧化酶與CPR 進行融合是一種常用的提高P450 效率的方式，但是對于一個包含多種P450 氧化酶的合成途徑就需要對每個P450 氧化酶進行CPR融合，這在一定程度上增加了工程菌的代謝負擔[54]。然而有研究表明，P450 氧化酶與CPR 的融合并不能提高P450 氧化酶活性，比如融合CPR 后的CYP725A4 的活性要低于獨立表達CYP725A4 及其CPR 時的活性[48]。這說明通過融合P450 與CPR促進P450 的活性并不是一種通用策略。由于細胞色素b5可以對P450氧化酶所需的第二個電子進行傳遞，因此與CPR 進行共表達時，細胞色素b5 會促進整體的電子傳遞效率從而提高催化活性，比如來源于黃花蒿的細胞色素b5 的應用，顯著提高了青蒿酸的產量[12]。CPR 與P450 氧化酶之間的不匹配也是導致電子傳遞效率低的重要原因，李春課題組通過對甘草轉錄組數據庫進行深度挖掘獲得更高效的P450還原酶GuCPR1，替換了來源于擬南芥的AtCPR1，其與CYP72A154 進行匹配時[32]，顯著提高了甘草次酸合成水平，同時通過來源于苜蓿的CPR 與CYP716A12 進行匹配，顯著提高了工程酵母合成齊墩果酸的效率[55]。

3.2 動態調控

由于天然產物的合成途徑涉及多個酶、多種反應，對于宿主體內輔酶、能量等公用物質的需求不同，同時多種中間產物也會對宿主產生不同的影響。因此這些反應、代謝物、酶與宿主之間的相互作用會對整個途徑的活性產生影響。為提高合成途徑的整體效率，研究人員使用了反應過程的動態調控策略。

動態調控可以根據細胞內外的環境變化對酶的表達水平、活性進行調節，進而控制代謝流的分配。一個動態調控系統需要具備兩個要素，一個可以響應特定代謝物的響應器以及一個活性受響應器介導的調節元素來控制特定代謝物的產生和消耗。動態調控被廣泛地應用于控制細胞毒性前體物質的合成來提高目標產物的合成效率。通過在紫蕙槐二烯合成途徑中使用FPP響應的啟動子構成一個FPP的反饋抑制回路，來控制FPP上游合成的八個基因的轉錄，降低因FPP的積累對大腸桿菌細胞產生的毒性，同時以一個FPP反饋激活回路來控制紫蕙槐二烯合酶的表達，促進FPP轉化為紫蕙槐二烯，使其產量從700mg/L 提高至1.6g/L[56]。Liang 等[57]通過一種可以同時響應底物阿魏酸以及產物香草醛響應器的應用，使細胞生長前期外源途徑的表達處于低水平利于產物緩慢積累從而最小化細胞毒性，當產物積累到一定程度，代謝途徑被激活，表達水平增高，從而大大提高合成效率，通過這種動態調控策略在促進細胞生長的同時顯著促進了香草醛的合成。動態調控還可用于調節內源途徑與外源途徑之間的代謝競爭，Scalcinati等[58]通過將鯊烯合酶的啟動子替換為一種葡萄糖誘導的啟動子，實現鯊烯合酶表達量隨葡萄糖變化動態調控機制，降低釀酒酵母中甾醇合成的代謝流，使其流向外源萜烯合成途徑，促進了工程酵母檀香烯的合成。動態調控策略的可用性取決于其調控元件的適用性，到目前為止，調控元件的獲取多是從微生物體內進行篩選，雖然避免了響應回路的重新構建，但是限制了其響應信號的多樣性。通過對響應元件進行改造，目前已經獲得可以響應己二烯二酸、黃酮以及丙二酰輔酶A的響應元件，但是由于難以獲得一種通用的篩選條件或設計方法，其應用依然受到限制[59-62]。Baker 課題組[63]通過蛋白質從頭設計，設計了一種cage-key模式的正交調控元件，并在哺乳動物細胞和釀酒酵母細胞中實現了對多種生理過程的動態調控，這種方法可以針對不同的底物進行理性設計，為獲得更多的動態響應元件提供了可能。

可以響應植物化合物的RNA 開關也可以作為動態調控元件，雖然當前對于RNA 開關的研究主要集中于產物濃度的檢測以及菌種篩選，在未來動態調控元件的研究中，RNA 開關也扮演著重要的角色。此外，利用光調控元件在不同光源的誘導下對代謝網絡進行動態調控也展現出了巨大的潛力[64]。

3.3 代謝途徑區室化

代謝途徑區室化是對產物合成途徑中的反應模塊進行不同的亞細胞定位，從而增加酶與特定底物的接觸或抑制副反應的發生，以達到抑制副產物合成以及提高合成途徑效率的目的。通過區室化可以增加局部的底物以及輔酶的濃度，促進反應的正向進行。烷類生物堿的前體L-鳥氨酸的合成途徑涉及位于細胞質中的谷氨酸合成反應，以及下游定位于線粒體的谷氨酸到L-鳥氨酸的轉化反應，將L-鳥氨酸合成途徑定位于細胞質的合成策略顯著提高了其合成效率[65]。區室化還可用于隔離催化非目標反應的酶，從而弱化競爭途徑代謝流的強度。利用酵母合成嗎啡時，酵母體內存在合成副產物neo-嗎啡的競爭代謝，蒂巴因6-O-脫甲基酶和可待因酮還原酶（COR）催化步驟之間的一步自發應的速率較慢，而COR既可以催化自發反應的底物，又可以催化自發反應的產物產生Neo-嗎啡。通過將這兩個酶定位于不同的亞細胞區室，為自發反應提供充足的時間，顯著降低了副產物的合成。除了亞細胞定位外，合成支架技術同樣可以實現反應的區室化，該方法可以促進蛋白質之間的相互作用，并強化底物通道作用，提高多酶反應效率。利用合成蛋白支架，對催化柚皮素合成兒茶酸的三步反應的酶進行共定位，顯著提高了工程大腸桿菌兒茶酸的合成。除蛋白支架外，在大腸桿菌中利用核酸支架對多步連續反應的酶進行共定位促進了L-蘇氨酸、琥珀酸等化合物的合成[66-67]。

3.4 代謝網絡再平衡

外源途徑引入后會與微生物內源途徑產生相互作用，從而使整個代謝網絡產生擾動，比如外源途徑會與基礎代謝競爭公共前體物質、輔酶等公用資源，同時外源途徑的產物也存在被內源酶代謝的可能。因此，對外源途徑以及內源代謝網絡進行重新分配和再平衡，對于增強流向目標產物的代謝流具有重要作用。

增強前體物質合成并且促進前體物質向目標途徑分配的最直接的方式和最有效的策略，是強化前體物質的合成途徑并降低競爭途徑對前體的消耗。研究人員通過強化MVA 途徑促進FPP 合成，同時使用銅離子抑制的啟動子來抑制ERG9的表達，降低了青蒿酸前體FPP流向副產物甾醇的反應，提高了酵母合成青蒿酸的效率[12]。Brown 等[68]通過過表達GPP 合成途徑的關鍵酶，同時消除GPP 對于上游途徑的反饋抑制促進GPP合成，結合敲除FPP合酶抑制GPP 的競爭性消耗，促進了GPP 代謝流向異胡豆苷的合成。

植物天然產物合成過程中涉及的酶如P450 氧化酶需要消耗NADPH，因此促進工程菌輔酶的再生與平衡對于促進目的產物的合成具有重要的作用。化學計量模型用于預測刪除靶點成功地強化了NADPH在大腸桿菌內的再生能力，提高NADPH依賴的酶催化效率，促進了工程菌植物黃酮的合成。利用NADH 依賴的酶替換NADPH 依賴的酶也是一種促進NADPH可用性的有效策略。利用NAD依賴的谷氨酸脫氫酶GDP2 替換NADPH 依賴的GDP1，顯著提高了NADPH的可用性，促進了α-檀香烯的合成[69]。除去基于理性設計的代謝工程外，基于CRISPR 等的全基因組篩選的非理性設計也是確定調控靶點、促進天然產物合成的重要手段。近年來出現的關于合成基因組的研究表明，可以刪除微生物中的一些非必須的代謝過程，在維持菌株適應性的同時提高基因組穩定性[6]。酵母合成基因組的發展以及Scramble 技術的應用為開發更加適用的宿主、研究天然產物合成過程中各個反應過程的相互關系、促進天然產物的合成效率提供了更多空間[70-71]。除此之外，混菌培養技術在天然產物合成中的應用展現出一定的應用前景，混菌培養技術可以將合成途徑中不同中間產物的合成模塊在能夠耐受不同毒性中間產物的宿主中進行整合，從而解決毒性中間產物積累抑制菌體生長、導致目標產物產量低的問題。通過大腸桿菌與酵母菌的混菌培養技術，成功地促進了taxadiene-5-ol、兒茶酸、花青素等天然產物的合成[72-74]。

4 結語

近年來，利用微生物合成結構復雜的高價值植物天然產物已經取得了許多突破性進展。一些化合物的合成水平已經達到克級，如人參皂甙[75]、青蒿酸[12]、對香豆酸等。對于微生物平臺的研究，已經能夠實現包含數十個酶的極其復雜的生物合成途徑構建。但是，對于植物天然產物的異源合成仍然有許多問題需要解決。

首先，由于植物和微生物細胞環境差異導致植物來源的酶在微生物異源表達時催化效率低，仍然是限制植物天然產物異源合成的重要因素。針對這一問題，通過解析合成植物天然產物關鍵酶的結構以及在不同細胞中的催化特異性機制，在此基礎上，對酶進行理性設計有望提高植物酶的異源活性。

其次，由于植物天然產物合成途徑復雜，涉及多步酶催化反應，使其在微生物中裝配困難、適配性差。因此在未來的微生物合成植物天然產物的研究中，需圍繞外源途徑的高效組裝機制及其與底盤細胞的適配性原理展開。通過探討外源途徑與底盤細胞在DNA、RNA、蛋白質、代謝等多層次水平的適配性原理，實現植物天然產物合成途徑在底盤細胞中的快速組裝和高效、可控、穩定表達。

另外，消除異源合成途徑對微生物自身生長代謝產生的干擾，是當前微生物合成植物天然產物過程中必須解決的問題。為實現微生物代謝流的智能調控，構筑智能細胞工廠，需要創建實時監測與高通量篩選技術，解析關鍵代謝物的轉運機制，開發高效正交基因組編輯調控和轉錄資源分配技術，平衡細胞生長與產物合成，提高微生物合成植物天然產物效率。

最后，實現微生物合成天然產物的規模化生產，需要解決當前研究過程中發酵規模放大的規律不清、特異性提取技術不成熟等問題，闡明微觀代謝調控與宏觀發酵控制的耦聯機制，建立響應溶氧、溫度、pH 和碳源等參數的智能精細發酵調控策略，發展高效分離提取技術，擴大生產規模，最終實現高價值植物天然產物的高效綠色生物制造。