白毛藤多糖對人卵巢癌A2780/DDP 細胞增殖和凋亡的影響

張杰，楊驕霞，翟鳳國，周福波，林峰，李厚忠，楊旭東＊

（1.牡丹江醫學院，黑龍江 牡丹江 157011；2.牡丹江醫學院附屬紅旗醫院，黑龍江 牡丹江 157011）

0 引言

順鉑(cisplatin，DDP)作用強、抗腫瘤譜廣泛，對卵巢癌療效顯著，是化療中常用的藥物。其作用機制主要是誘發DNA 單鏈內或雙鏈間相鄰鳥嘌呤產生交聯進而破壞DNA，抑制細胞DNA 自我復制[1-2]，但長期使用順鉑往往產生耐藥性，限制其在臨床化療的應用。白毛藤（Solamum lyratum Thunb）屬于茄科植物，具有消腫、解毒等作用。本課題組前期實驗證實，白毛藤的不同組分對多種腫瘤細胞具有生長抑制等作用[3-4]，本研究旨在進一步觀察白毛藤多 糖（Solamum lyratum Thunb polysaccharide，SLTP）在逆轉A2780/DDP 人卵巢癌順鉑耐藥中的作用及其分子機制，為SLTP 應用于卵巢癌的輔助化療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

A2780/DDP 人卵巢癌順鉑耐藥細胞株，購于中科院上海細胞庫。四甲基偶氮噻唑藍(MTT)、RPMI-1640 培養液和RNA 提取試劑(Trizol) (美國Sigma公司)，胰酶（美國Gibco 公司），DDP（德州德藥制藥有限公司），RT-PCR 試劑盒及引物（大連寶生物有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞分組

實驗分為4 組，空白對照組（含A2780/DDP 細胞的RPMI-1640 培養液）、順鉑組（2μg/mLDDP）、順鉑+低劑量SLTP 組（2μg/mLDDP+0.4mg/mLSLTP）、順 鉑+高劑量SLTP 組（2μg/mLDDP+1.6mg/mLSLTP）。

1.2.2 測定藥物敏感性的MTT 實驗

將對數生長期A2780/DDP 細胞，以5×103個/mL細胞密度，接種至96 孔培養板上，每孔100 μL。按照細胞分組，分別加入不同濃度DDP 和SLTP，每個濃度設5 個復孔。分別孵育12，24 和48h 時各加入5g/LMTT20μL 溶液；繼續培養4h，吸去全部上清液，每孔加100μLDMSO，酶標儀測定波長490nm 的各孔OD 值。細胞抑制率（inhibition rate，IR）=（對照組OD-實驗組OD）/（對照組OD-空白組OD）×100%。

1.2.3 Hoechst33258 檢測細胞凋亡

按照Hoechst33258 熒光染料試劑說明書檢測A2780/DDP 細胞凋亡情況。固定：固定液4℃，10 min；漂洗：0.01mol/L PBS 漂洗3 次，5min/次；染色：Hoechst33258 染色液（5mg/L）染色15min；封片：封片劑（甘油與PBS 比例為1:9）封片。顯微鏡下觀察到的藍色深染、細胞核碎裂的細胞為凋亡細胞。細胞凋亡率={凋亡細胞/（凋亡細胞+正常細胞）}×100%。

1.2.4 反轉錄-聚合酶鏈式反應（RT-PCR）檢測

設計引物如下：PTEN上游：5'-ATACCAGGACCAGAGGAAACCC-3'；下游：5'-TTGTCATTATCCGACGCTC-3'，擴增片段為101 bp。Survivin 引物，上游：5'-TTGGCAGGTGCCTGTTGAAT-3'；下游：5'-AGCCAGTCCCCCACAGCAT-3'，擴增片段329bp。GAPDH上游引物：5'-CGCCTGGAGAAAGCTGCTA-3'，下游：5'-ACGACCTGGTCCTCGGTGTA-3'，擴增片段288bp。條件：95℃預變性3min，94℃變性30s，55℃復性60s，72℃延伸55s，40 個循環，72℃復性5min。凝膠成像系統拍照，軟件分析PTEN、SurvivinmRNA 的相對表達量。

1.2.5 統計學分析

2 結果

2.1 各組A2780/DDP 細胞藥物敏感性情況

順鉑+低劑量SLTP 組和順鉑+高劑量SLTP 組能明顯提高對A2780/DDP 細胞的生長抑制率，抑制腫瘤細胞生長，與順鉑組比較具有顯著性差異（P＜0.01，P＜0.05），見表1。

表1 各組細胞生長抑制率（）

表1 各組細胞生長抑制率（）

注：與順鉑組比較，##P＜0.01，#P＜0.05。

2.2 各組細胞凋亡情況

不同濃度SLTP 聯合順鉑作用于A2780/DDP 細胞后，各組細胞的凋亡率各不相同，與空白對照組凋亡率（2.98%）比較，順鉑組凋亡率（14.94%）顯著升高（P＜0.01）。與順鉑組比較，順鉑+低劑量SLTP 組（17.17%）和順鉑+高劑量SLTP 組（23.61%）凋亡率明顯增加，差異有統計學意義（P＜0.01，P＜0.05），見圖1、2、3、4。

圖1 空白對照組（400×）

圖2 順鉑組（400×）

圖3 順鉑+低劑量SLTP（400×）

圖4 順鉑+高劑量SLTP 組（400×）

2.3 各組細胞PTEN、Survivin 基因表達情況

與順鉑組比較，不同劑量SLTP 聯合順鉑作用于A2780/DDP 細胞48h 后，A2780/DDP 細胞中凋亡抑制因子Survivin 表達降低（P＜0.01，P＜0.05），促進細胞凋亡增加化療敏感的PTEN表達增加（P＜0.01，P＜0.05），順鉑+高劑量SLTP 組最顯著（P＜0.01），見表2、圖5、6。

表2 各組A2780/DDP 細胞PTEN 和Survivin 基因表達（）

表2 各組A2780/DDP 細胞PTEN 和Survivin 基因表達（）

注：與空白對照組比較,** P＜0.01，* P＜0.05；與順鉑組比較,##P＜0.01，# P＜0.05。

圖5 各組細胞survivin 基因表達

圖6 各組細胞PTEN 基因表達

3 討論

目前我國婦科的惡性腫瘤中死亡率最高的是卵巢癌[5-6]，順鉑是術后恢復的患者聯合化療的基礎[7]。化療的關鍵是提高順鉑的敏感性，降低耐藥性，同時降低順鉑毒副作用。細胞凋亡抑制是腫瘤發生機制之一，抗凋亡基因及凋亡基因在這一過程中發揮著重要的作用，因此成為了卵巢癌治療中的一個潛在的靶點。PTEN 基因定位于10 號染色體短臂（10q23.3），是一個雙特異性磷酸酶活性的抑癌基因，可調控細胞周期，也可參與細胞間粘附[8-9]，作用于在多種腫瘤中可增加多種化療藥物的敏感性[10]。本研究證實，高低劑量的SLTP 分別與順鉑合用可明顯上調A2780/DDP 細胞中PTEN 基因表達，隨著藥物劑量的增加，A2780/DDP 細胞中PTEN 基因表達逐步上調，與順鉑組比較，差異具有統計學意義。Survivin 屬于凋亡抑制蛋白家族，不僅與腫瘤的發生發展有關，也與腫瘤化療敏感性密切相關[11-12]。本研究證實，高低劑量的SLTP 分別與順鉑合用可明顯下調A2780/DDP 細胞中Survivin 基因表達，隨著劑量的增加，細胞中Survivin 基因表達顯著下調，與順鉑組比較，差異具有統計學意義。

綜上所述，SLTP 可通過調控Survivin 及PTEN基因的表達，從而輔助順鉑誘導A2780/DDP 細胞的凋亡并抑制A2780/DDP 細胞增殖，增加順鉑的藥效。為SLTP 進一步應用于卵巢癌順鉑耐藥的輔助治療提供理論及實驗依據，但其具體協同作用機制尚待進一步研究。