口岸動物疫病ELISA 檢測的影響因素分析及優化方法探析

林萍萍，安鵬天，史云鵬

（黃驊港海關，河北 滄州 061600）

近年來，隨著我國畜牧業的快速發展，改良品種，優化牛類種群遺傳性能的需求日益增加，境外引種就成了重要途徑，其促進我國養殖業和經濟貿易發展的同時，也增加了疫病傳入的風險。加強進境種牛檢驗檢疫和監管已成口岸動物檢疫面臨的重要課題，實驗室疫病檢疫發揮著重要的作用。酶聯免疫（Enzyme-linked immunosorbnet assay，ELISA）是把抗原抗體免疫反應的特異性和酶的高效催化作用有機結合起來的一種檢測技術，原理是抗原或抗體吸附于固相載體進行免疫酶反應，經底物顯色后用酶標儀進行檢測，由于待測譜物的含量與呈色物質的顏色具有相關性，因此可以通過顏色的不同來達到定性定量分析待測樣品的目的。由于ELISA方法具有操作簡單、靈敏度高和特異性高等特點，并且適合批量樣品檢測，因此廣泛應用于口岸進境種牛疫病檢測。但實驗室在實驗操作過程中因諸多因素影響檢測結果的準確性，即會出現一些假陽性或假陰性，因此，有必要深入分析其影響因素，并優化方法規范實驗操作，確保實驗結果準確有效，把好國門生物安全，也為動物疫病檢測工作的開展提供依據，本文就種牛疫病ELISA 檢測的影響因素從“人員、設備、材料、方法和標準、環境”等多個方面進行分析。

1 人為因素

實驗室專業技術人員是開展動物疫病檢測的中心人員，是影響實驗結果準確性的重要因素，因此要求從事相關工作的實驗室人員要求必須具備較強的專業知識和熟練的操作技能。在種牛疫病ELISA 檢測實驗中，血清樣品處理、移液器使用不當、酶標洗板的徹底程度等都會對結果造成直接的影響。為此，應對實驗人員定期組織開展業務培訓考核、能力驗證和人員比對等，持續保證實驗人員熟悉實驗操作流程和儀器設備的操作能力，以便保質保量的完成動物疫病檢測工作。

2 設備因素

儀器設備的準確度是進行實驗檢測最基本的要求，是影響檢測結果的直接因素之一。不同廠家儀器設備存在檢測性能的差異如洗板機，進口的性能要高于國產，在洗板時洗出的徹底。為了確保檢測結果真實有效，實驗室應定期對檢測儀器進行計量檢定、維護，使用前進行校準，確保儀器可以正常運行。

3 材料因素

3.1 樣品因素

待檢樣品的質量是確保實驗結果準確性的重要因素，因此樣品要求新鮮和純凈。種牛疫病ELISA 實驗一般采用種牛血清進行檢測。

3.1.1 樣品采集及送檢 在采集樣品時，應使用無菌采集針管，盡量避免反復顛倒，嚴防樣品溶血的產生，因樣品的溶血血紅蛋白中含有類過氧化物酶活性的亞鐵血紅素，在以辣根過氧化物酶（HRP）為標記的ELISA 實驗中，會增加非特異性顯色造成假陽性結果的產生，因此，應盡量避免溶血，對嚴重溶血樣品需重新采樣。工作人員需要對采集的樣本進行檢查，包括樣品質量、數量、標識、記錄等，避免出現樣品采集錯誤。及時將樣品送往實驗室檢測，血清樣品放置時間過長，易受細菌污染，而細菌體內可能有內源性HRP，出現非特異性顯色，造成假陽性結果的出現。

3.1.2 樣品處理 分離血清需要注意幾點問題：分離血清時核對好樣品編號，樣品一式兩份，一份待檢樣品，一份留樣保存，血清可冷藏自然析出，也可離心析出，但需控制離心的速度和時間，過度離心會造成紅細胞破裂，影響實驗結果。

3.1.3 樣品保存 如不能及時檢測，應將樣品冷藏或冷凍保存，盡量避免反復凍融，反復凍融會破壞樣品中的蛋白分子如抗體，造成假陰性結果的出現。一般來說，一周之內進行檢測，將樣品存放在2～8℃即可，如因特殊原因需延時檢測，可將樣品及時分裝后放置于-20℃或-80℃冷凍保存。

3.2 試劑因素

3.2.1 試劑盒的選擇 選擇合適的試劑盒是影響實驗結果的關鍵因素。目前口岸種牛疫病檢測常用進口試劑盒如IDVET、BIOVET、kernel 等，實驗結果表明不同廠家的試劑盒由于采用的方法不同（競爭ELISA、阻斷ELISA、夾心ELISA等）檢測結果存在差異性。因此選購試劑盒時，需全面了解其技術參數、性能指標，使用時注意試劑盒的有效期及保存溫度，如果保存不當或使用過期試劑盒均會影響實驗結果。另外，同一廠家試劑盒不同批次之間不能混用，在其制作過程很難保證質量完全一致，容易造成結果差異現象。

3.2.2 試劑盒的回溫 在實驗過程中對試劑的準備不太注意，經常會出現試劑盒從冰箱剛拿出來就開始實驗，會出現陽性對照、洗滌液等試劑沒有化開的現象，從而影響實驗反應時間，其直接后果會導致對一些弱陽性樣品的檢測出現假陰性。因此在ELISA 實驗開始前，最為關鍵的是將試劑盒提前從冰箱里拿出來，按說明書要求在室溫放置30min 至與室溫平衡，并避免陽光直射，其目的是使微孔內的溫度能較快的達到后面測定的需求溫度。

4 方法和標準的因素

檢測方法、標準規范和質量控制程序及其相關計劃是也是影響實驗結果的直接因素之一。檢測方法嚴格按照標準和相關技術規范進行選擇，種牛疫病ELISA 檢測時應遵循標準選擇相適宜的試劑盒，并定期對檢測流程和標準進行修訂，避免在檢測過程中使用已作廢的方法進行檢測，從而影響實驗結果的準確性。實驗室的質量控制及其相關計劃是監控檢測過程最有效的手段，按計劃進行實驗人員比對、留樣再測、測量審核等質量控制，確保檢測數據的準確性，在此過程中如出現異常，及時找出原因，并提出改進的相關措施。適宜的檢測方法和標準為實驗人員能夠提供較好的理論基礎和技術指導。

5 環境因素

實驗室的環境是影響實驗結果的先決條件，即檢測過程所在的環境溫度、濕度及純潔度等，必須滿足國家相關的法律法規、技術規范或標準的要求。室溫對ELISA 實驗結果有影響，室溫偏低會對樣品和試劑產生影響，導致反應速度慢，進而影響實驗結果。實驗過程中所用的物品及周邊環境受到污染，也會對實驗結果產生影響。對此，應每周對實驗室的溫濕度等相關記錄進行查巡并實時記錄，定期對實驗室進行清潔消毒，保證實驗室環境滿足實驗要求，消除其對實驗室結果帶來的影響。

6 實驗關鍵環節因素

6.1 加 樣

加樣是影響ELISA 結果的最常見的因素，樣品稀釋，嚴格按照不同試劑盒對樣品稀釋倍數規定進行操作，其目的是減少非特異性反應，所以在檢測過程中一定是先加稀釋液再加樣品，需要引起注意的是加樣后要在微量振蕩器上震蕩混勻30s，防止溢出。

在種牛疫病ELISA 初篩實驗中，由于檢測量比較大，一般采用多通道微量移液器，使用多通道微量移液器需要注意幾點：正確使用，使用前調整移液器的加樣量；加樣速度不可過快，否則無法保證微量加樣的準確度和均一性；避免將樣品加到反應孔壁上，因為孔壁上部是非包被區，易導致非特異性吸附，造成假陽性結果的出現；避免產生氣泡和濺出，氣泡會引起反應界面差異，濺出會造成相鄰孔污染；避免槍頭碰觸到孔底部，并保持孔外底部潔凈，有利于酶標儀檢測。移液器長時間使用會出現磨損或內部附著血痂等原因造成加樣不準確，因此有必要定期對移液器進行維護和計量校準。此外，樣品較多時應分批檢測，避免加樣后溫育前等待時間超時。

6.2 溫 育

溫育是ELISA 檢測中最關鍵、也是最容易出現問題的環節。ELISA 實驗中抗原抗體反應必須保證一定的時間的溫育，且溫育所需要的時間一般與溫度成反比。種牛疫病檢測中最常用的溫度是37℃和室溫，溫度過高或溫育時間不夠，易造成弱陽性樣品漏檢情況。因此，在日常檢測過程中，要嚴格按試劑盒說明書控制溫育的時間和溫度，不能人為延長或縮短溫育時間，應根據不同的室溫條件下及時調整溫箱的溫度，在溫箱放置溫濕度計來測量觀察即可。溫育時，需在酶標板表面貼粘膜，防止孔內液體蒸發或水珠等異物掉入孔內引起污染。切記封板膜不能重復使用，以免引起交叉污染。

6.3 洗 板

洗板是ELISA 實驗中操作次數最多的，是重要環節，應引起實驗人員的重視。洗板次數減少，洗板不徹底造成殘留，可能引起假陽性結果的產生，洗板次數過多，可能會洗脫掉抗原抗體結合物，引起看假陰性結果。無論是手工洗板還是洗板機洗板，要嚴格按照試劑盒說明書規定的洗滌次數、洗滌體積、洗滌時間進行操作，不能人為改變洗板要求。在洗板的過程中，盡量保證操作標準，如避免洗板液過多溢出孔外，甩板要快速干凈，使用干凈的濾紙不在同一地方重復拍板等，操作的準確與非直接影響檢測結果的重復性和準確性。

7 結語

口岸進境動物檢驗檢疫的核心任務就是防止危險性疫病疫情傳入國內，控制動物疫病跨境傳播和擴散，保障我國養殖業生產安全、動物生命和人民的身體健康，做好口岸動物疫病檢驗檢疫工作尤為重要。ELISA 自建立以來，由于其自身的優勢被廣泛應用于海關、獸醫實驗室、科研單位等，但實驗過程中有諸多因素影響檢測結果的準確性，應對其原因進行深入分析，及時進行整改。首先要保證實驗室環境設施和儀器設備處于良好狀態，其次，實驗涉及的試劑及檢測方法必須標準化，及時更新檢測標準和技術規范，另外實驗技術人員須定期培訓，加強業務學習，提高專業技能，嚴格按照實驗室規章要求進行樣品的檢測，在一次又一次的實踐中對這些關鍵環節進行探索和優化，認真避免或減少影響因素，盡量避免假陽性和假陰性結果的出現，提升口岸動物疫病的檢驗檢疫技術水平，確保數據準確可靠，從而保障國內養殖業健康和可持續發展。