CDK4在骨肉瘤中的研究進展*

張 兵 綜述，李大鵬，毛良浩 審校

(江蘇大學附屬醫(yī)院脊柱外科，鎮(zhèn)江 212001)

骨肉瘤是未成年人常見的原發(fā)性高度惡性骨腫瘤[1]，是一種極具侵襲性的惡性腫瘤，目前一般認為起源于間葉組織。骨肉瘤雖然在臨床診治方法方面已取得了很大的進步，包括手術(shù)切除、新輔助或輔助化療和放療，但轉(zhuǎn)移性或復(fù)發(fā)性患者5年生存率僅為20%[2]。骨肉瘤的發(fā)生和發(fā)展可能涉及基因突變、染色體變異和DNA異常甲基化等病理和生理機制，但依然存在許多盲點。

癌癥的特性之一是細胞不受節(jié)制地增殖和生長，細胞周期機制控制著細胞的增殖。細胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinases，CDK)在腫瘤中常過度表達和過度活躍，這是由于各種遺傳和表觀遺傳事件影響了它們的調(diào)節(jié)途徑，導(dǎo)致檢查點完整性的喪失，并最終導(dǎo)致不受控制的細胞增殖和惡性轉(zhuǎn)化[3-4]。CDK4是細胞周期依賴性蛋白激酶家族一員，是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是調(diào)節(jié)細胞周期的核心因子之一。有研究發(fā)現(xiàn)，CDK4在乳腺癌[5]、肝癌[6]等多種腫瘤的發(fā)生過程中均發(fā)生了改變。此外，CDK4在人骨肉瘤細胞和組織中也呈高表達，且與骨肉瘤患者預(yù)后不良相關(guān)[7]。這些發(fā)現(xiàn)提示了CDK4在人骨肉瘤中扮演了重要角色。CDK4的表達異常有可能涉及調(diào)節(jié)CDK4的因子異常和(或)影響細胞增殖的活性物質(zhì)表達的變化。現(xiàn)將CDK4在骨肉瘤的作用機制及臨床意義的研究進展綜述如下。

1 CDK4在調(diào)控細胞周期中的作用

CDK是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，參與了細胞周期的進程。隨著細胞周期的進行，各種CDK隨著細胞周期的進展而交替發(fā)揮作用。CDK調(diào)節(jié)細胞周期轉(zhuǎn)變，使細胞周期有序地進行。特別是CDK4/6通過控制G1期限制點向S期的過渡，在細胞增殖中具有重要作用。

CDK4通過與細胞周期蛋白D(cyclin D)結(jié)合從而調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜母細胞瘤(retinoblastoma,Rb)蛋白磷酸化，促進了細胞由G1期向S期推進[8]。磷酸化后的Rb蛋白與E2F轉(zhuǎn)錄因子(E2F transcription factor，E2F)解離，釋放出E2F轉(zhuǎn)錄因子參與細胞由G1期向S期轉(zhuǎn)換，而未磷酸化的Rb蛋白與E2F轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合并抑制其功能而抑制細胞增殖。cyclin D- CDK4/6活性的增加可促進Rb蛋白磷酸化，促進細胞增殖狀態(tài)。p16INK4A基因(p16INK4A gene，p16INK4A)是CDK4的負調(diào)控因子，p16INK4A缺失上調(diào)了CDK4表達，使Rb蛋白磷酸化水平升高，導(dǎo)致細胞周期進程加快[9]。CDK4在調(diào)控細胞周期中具有重要作用，通過抑制CDK4在骨肉瘤中活性和(或)表達可以達到抑制骨肉瘤增殖和轉(zhuǎn)移的目的。

2 CDK4在骨肉瘤中的作用機制研究

2.1 骨肉瘤中染色體和基因變異對CDK4的作用

有研究表明，CDK4基因改變可導(dǎo)致CDK4表達的改變，其基因改變涉及染色體和DNA甲基化[10-11]。有學者指出，在骨肉瘤中出現(xiàn)染色體12q13～15區(qū)域的擴增，該區(qū)域包含2個不同的擴增子，一個在12q15以MDM2為中心；另一個在12q13～14以CDK4為中心，這2個區(qū)域在骨肉瘤中經(jīng)常同時擴增，MDM2和CDK4擴增與這2個基因的高表達水平相關(guān)[10,12]。7q22～q34區(qū)域與人類染色體帶12q13～q15/8q24/22q11～q13同源，包括Mdm2、Cdk4、c-Myc、Pdgf-b基因位點。也有研究表明，CDK4基因是骨肉瘤中染色體7q22～34處頻繁增加的靶基因，染色體7q22～34區(qū)域的增加促進了CDK4的表達[13]。這些染色體的改變通過擴增CDK4影響正常細胞周期進程，從而促進骨肉瘤增殖和轉(zhuǎn)移，可能有助于進一步了解人類骨肉瘤發(fā)生和發(fā)展的分子機制，然而CDK4基因表達仍可能受基因組增益以外的機制調(diào)控。

CpG島常處于基因的啟動子和外顯子區(qū)域，與人類基因組編碼基因相關(guān)，位于基因轉(zhuǎn)錄區(qū)域CpG的甲基化狀態(tài)影響基因的表達，對腫瘤的研究意義重大。在基于骨肉瘤的DNA甲基化和基因表達譜的CpG甲基化模式研究中，整合分析差異化基因(DEGs)和差異甲基化基因后發(fā)現(xiàn)，MEF2轉(zhuǎn)錄因子水平升高，上調(diào)了下游靶點CDK4表達[11]。同時CpG異常甲基化也存在于CDK4的抑制因子p16INK4A中，p16INK4A中的CPG島的甲基化使p16INK4A表達缺失，導(dǎo)致cyclin D-CDK4/6失調(diào)[9]。也有研究表明，p16INK4A的表達抑制了Brca1啟動子以Rb-E2F依賴方式的CDK4的表達[14]。CDK4的異常擴增也可能是基因突變所致，如Rb基因突變導(dǎo)致CDK4異常擴增[15]。p16INK4A的缺失上調(diào)了CDK4表達，促進Rb蛋白磷酸化，加快了G1期到S期細胞周期的進展。這些變化也可能來自包括p16INK4A突變失活、cyclin D過表達和產(chǎn)生無法與p16INK4A相互作用的CDK4突變體等。這些改變通過促進CDK4基因表達，在促進骨肉瘤增殖和轉(zhuǎn)移的發(fā)展中可能充當著重要角色。染色體和基因變異在CDK4發(fā)揮著關(guān)鍵作用。

2.2 骨肉瘤中非編碼RNA對CDK4的作用

在CDK4的表達過程中，其接受特定RNA的調(diào)控，可能在腫瘤發(fā)生和發(fā)展進程中承擔著不可或缺的作用。這些調(diào)控骨肉瘤細胞中CDK4表達的RNA涉及微小RNA(micro RNA，miRNA)、長非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)等。miRNA是一種非編碼單鏈RNA分子，參與了基因的表達。有研究表明，miRNA-506-3p在骨肉瘤細胞中具有抑癌作用，miRNA-506-3p在骨肉瘤細胞中表達降低，導(dǎo)致Rab-3D表達增加，進而導(dǎo)致CDK4和MMP9(matrix metalloprotein 9,MMP9)表達活性增加，導(dǎo)致腫瘤細胞增殖和轉(zhuǎn)移[16]。也有學者指出，骨肉瘤細胞中過表達miR-590-3p可增加P53和P21表達，抑制增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)、cyclin、CDK4表達而抑制腫瘤細胞增殖和遷移[17]。同時也有研究者證實，miR-212[18]及miR-505[19]等可抑制骨肉瘤細胞中CDK4的表達而抑制骨肉瘤的生物學行為。而miR-203a可上調(diào)cyclin D1、cyclin B1、CDK1、CDK4的表達，而lncRNA GAS5負調(diào)控miR-203a，lncRNA GAS5沉默對MG-63細胞生長和轉(zhuǎn)移的促進作用被miR-203a抑制而逆轉(zhuǎn)[20]。lncRNA FBXL19-AS1通過調(diào)控miR-346影響骨肉瘤細胞中CDK4的表達而影響腫瘤的惡性行為能力[21]。miRNA連同其靶基因已被證明是骨肉瘤潛在的治療性生物標志物[22]。研究骨肉瘤中miRNA對CDK4的作用可能有助于更好地理解骨肉瘤的發(fā)生和發(fā)展的機制，并為臨床治療骨肉瘤帶來新的線索。

2.3 骨肉瘤中細胞因子和激素對CDK4的作用

在骨肉瘤的產(chǎn)生及分化的過程中，細胞內(nèi)某些蛋白和(或)因子可通過調(diào)節(jié)CDK4參與調(diào)控腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移。如絲氨酸蛋白酶抑制劑E2(SerpinE2)，是Serpins家族的成員之一，可抑制絲氨酸蛋白酶，促進腫瘤進展，尤其是在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中。SerpinE2在骨肉瘤組織中表達水平升高，特別是在轉(zhuǎn)移期患者的組織中，SerpinE2的高表達導(dǎo)致了骨肉瘤患者的低生存率，SerpinE2的表達與CDK4、cyclin D1在骨肉瘤細胞中表現(xiàn)出正相關(guān)，且轉(zhuǎn)染SerpinE2后骨肉瘤細胞對硼替佐米和阿霉素的耐藥性增加，SerpinE2在骨肉瘤中的高表達可通過提高CDK4、cyclin D1水平刺激細胞增殖，促進藥物耐藥性，并導(dǎo)致不良生存[23]。而S100A9表達下調(diào)促進p27表達，進而抑制了CDK2、CDK4活性，這種抑制作用導(dǎo)致低磷化Rb蛋白大量積累，通過抑制細胞周期從G1期向S期的轉(zhuǎn)變抑制U2OS人骨肉瘤細胞的增殖[24]。蛋白是生命活動的主要承擔者，上述蛋白在骨肉瘤中低表達從而促進CDK4的表達參與了骨肉瘤的增殖和轉(zhuǎn)移的進程，但為何在骨肉瘤中這些蛋白低表達值得更深層次的研究。

在體內(nèi)有些激素可能參與了骨肉瘤的形成。有學者指出，褪黑素在肺癌中可發(fā)揮抗腫瘤作用[25]。相似的研究發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤的發(fā)生和褪黑激素的減少似乎是同時發(fā)生的，隨后證明褪黑素下調(diào)G1期相關(guān)的cyclin D1和CDK4，與G(2)/M期相關(guān)的cyclin B1和CDK1，增加了細胞周期G0/G1期細胞比例，同時降低了S期和G(2)/M期細胞比例，抑制細胞在體內(nèi)的增殖和轉(zhuǎn)移[26]。腫瘤的發(fā)生和發(fā)展需依賴于腫瘤細胞獲得維持惡性生長的能力，體內(nèi)激素是否在其中具有重要的作用，其是否在骨肉瘤中有作用值得后續(xù)研究。

3 CDK4在骨肉瘤中的臨床意義

3.1 CDK4在骨肉瘤中的診斷意義

確診和區(qū)分骨肉瘤的類型可為下一步治療提供診療意見，為進一步優(yōu)化治療方案提供支持。MDM2、CDK4在低分化骨肉瘤中表達有助于支持低分化骨肉瘤的診斷[27-29]。低級別骨肉瘤在放射學和組織學上可與纖維和纖維骨性病變(如纖維瘤病和纖維異常增生)混淆，低級別骨肉瘤中MDM2、CDK4的免疫組織化學表達具有特異性，有助于將其與良性纖維性骨組織病變和良性腫瘤區(qū)分開來[27,30]。此外，在低級別骨肉瘤中一些偶爾會分化為高級別骨肉瘤，在組織學上與傳統(tǒng)骨肉瘤難以區(qū)分，MDM2、CDK4在低分化骨肉瘤和去分化骨肉瘤中經(jīng)常被擴增，而MDM2、CDK4對那些從低級別骨肉瘤進展而來的高級別骨肉瘤具有靈敏度和特異性，免疫組織化學可能有助于識別這一去分化亞群進行精確的亞分類[31]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，CDK4、MDM2的共表達可區(qū)分骨肉瘤類型，但其陰性不能排除骨肉瘤[29]。因此，CDK4的免疫組織化學特異性表達為臨床醫(yī)師對骨肉瘤的診斷及分型提供了診療意見，也在很大程度上為個體化和精準化治療提供了治療依據(jù)。然而，仍存在部分CDK4陰性表達的骨肉瘤，這也是臨床診療面臨的困難，需探索其他可能的骨肉瘤標志物與CDK4聯(lián)合診斷，以提高骨肉瘤篩查率。

3.2 CDK4 抑制藥物的研究進展

基于在惡性腫瘤細胞增殖和轉(zhuǎn)移過程CDK4的惡性生物學作用，CDK4抑制藥物的研究在不斷的探索中。首個CDK4抑制劑——palbociclib已獲批用于乳腺癌的治療，治療骨肉瘤的CDK4抑制藥物也在研發(fā)中。如palbociclib和CDK4特異性小干擾RNA抑制CDK4/6-cyclinD-Rb信號通路，抑制骨肉瘤細胞增殖和生長[7]。動力蛋白抑制劑 (Dynasore)[32]和斑蝥酸鈉[33]等也已被研究證實可通過直接或間接作用抑制CDK4表達而抑制骨肉瘤的增殖和轉(zhuǎn)移。 這些藥物的研究為CDK4抑制藥物在骨肉瘤中治療的可行性提供了支持，為骨肉瘤治療藥物的研究打開了新的方向，同時也為CDK4抑制藥物與其他抗腫瘤藥物聯(lián)合應(yīng)用提供了新的思路。通過聯(lián)合用藥增強抗腫瘤藥物的敏感性、降低抗腫瘤藥物的不良反應(yīng)存在巨大的研究價值。但這些藥物的研究目前僅局限于臨床前的基礎(chǔ)研究，尚需得到進一步的臨床考證。

4 小結(jié)與展望

骨肉瘤的發(fā)生和發(fā)展是多因素共同作用的結(jié)果，在調(diào)控骨肉瘤細胞周期進程中CDK4具有核心地位。在骨肉瘤細胞中CDK4的擴增加快了細胞周期G1期到S期轉(zhuǎn)變。CDK4的擴增涉及染色體變異、甲基化、基因突變和細胞因子表達的改變等。但在骨肉瘤中CDK4擴增機制的研究尚未完全成為一個體系。CDK4在骨肉瘤中的高表達差異性為在臨床工作中診斷骨肉瘤、分型、治療及預(yù)后提供了依據(jù)。CDK4抑制劑已在乳腺癌中應(yīng)用，在骨肉瘤基礎(chǔ)研究中也取得了初步進展。但在臨床應(yīng)用方面缺乏有效的研究。探索在骨肉瘤中CDK4的作用機制，以及CDK4抑制藥物的研究、CDK4抑制藥物與其他抗骨肉瘤藥物聯(lián)合應(yīng)用以實現(xiàn)精準化和個體化治療后續(xù)存在較大研究空間及價值。深入研究骨肉瘤中CDK4作用將會為骨肉瘤的精準和個體化診治提供更多的選擇。