利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建大鼠CCKAR敲除載體

劉驚濤，李知宗，林顯光，陳恒玲

(中南民族大學 生物醫(yī)學工程學院/腦認知國家民委重點實驗室/醫(yī)學信息分析及腫瘤診療湖北省重點實驗室，武漢 430074)

1 膽囊收縮素A受體與CRISPR/Cas9系統(tǒng)工作原理

1.1 膽囊收縮素A受體

膽囊收縮素(Cholecystokinin，CCK)由腸I細胞分泌，CCK可通過內(nèi)分泌、旁分泌、自分泌和神經(jīng)分泌等多種形式調(diào)節(jié)多種細胞功能[1]。研究提示，CCK可能與糖尿病的發(fā)病存在密切關(guān)系[1]。在胰島中，CCK可以通過膽囊收縮素A受體(Cholecystokinin A receptor，CCKAR)來調(diào)控胰腺中各個細胞的功能。大量事實證明，CCKAR基因與動物的日采食量和平均日增重有明顯關(guān)聯(lián)。Takiguchi通過研究發(fā)現(xiàn)，CCKAR基因能維持動物體內(nèi)的血糖濃度[2]。膽囊收縮素A型受體基因與幻聽相關(guān)[3]，膽囊收縮素A型受體與人群膽道癌及膽石癥易感性有一定關(guān)系[4]。

1.2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)工作原理

CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)被稱為規(guī)律成簇間隔短回文重復序列。Cas9是CRISPR相關(guān)核酸酶，CRISPR/Cas9是最新出現(xiàn)的一種由gRNA指導的、利用Cas9核酸酶對靶向基因進行編輯的技術(shù)。CRISPR系統(tǒng)主要依賴crRNA和tracrRNA來對外源DNA序列進行特異性降解。crRNA通過堿基互補配對，與tracrRNA結(jié)合，形成tracr/crRNA復合物。此復合物引導核酸酶Cas9蛋白與crRNA互補配對的序列靶位點剪切雙鏈DNA。CRISPR/Cas9系統(tǒng)由于其突變效率高、制作簡單、成本低，被廣泛應用于基因組的精確修飾，是一種具有廣闊應用前景的基因改造分子工具[5-7]。研究使用的載體為pL-CRISPR.EFS.GFP(載體信息見ADDGENE :57818)。

2 實驗部分

2.1 實驗材料

BsmbⅠ限制性核酸內(nèi)切酶(美國Thermo Scientific公司生產(chǎn))、CCKAR Oligo序列(武漢Tsingke公司生產(chǎn))、T4 DNA連接酶(武漢淼靈生物公司生產(chǎn))、pL-CRISPR.EFS.GFP(實驗室提供)、5× Annealing buffer(上海Beyotime公司生產(chǎn))、質(zhì)粒提取試劑盒(美國OMEGA公司生產(chǎn))、DH5α感受態(tài)細胞(武漢Tsingke公司生產(chǎn))、PCR儀(美國Veriti公司生產(chǎn))、抗生素(中國Bioshap公司生產(chǎn))、電泳槽和電泳儀(美國Bio-rad公司生產(chǎn))、凝膠成像系統(tǒng)(英國SYNGENE公司生產(chǎn))、恒溫搖床(美國Thermo Scientific公司生產(chǎn))。

2.2 實驗方法

2.2.1 pL-CRISPR.EFS.GFP質(zhì)粒提取

按照OMEGA質(zhì)粒提取試劑盒(D6950-01)中的提取方法進行pL-CRISPR.EFS.GFP質(zhì)粒的提取。

2.2.2 設(shè)計oligo

使用CRISPR設(shè)計工具得到guide RNA，用軟件根據(jù)堿基互補配對原理得到兩條Oligo DNA。實驗使用的CCKAR基因的單鏈Oligo DNA如表1。

表1 CCKAR基因的Oligo 序列

2.2.3 Oligo退火

將設(shè)計好的CCKAR基因的兩條Oligo按照表2的退火體系進行退火，退火條件為95℃，10 min；95℃～45℃，每2 min降1℃；45℃～16℃，每1 min降1℃。退火之后形成雙鏈Oligo。將退火后的產(chǎn)物用水按照1∶100進行稀釋備用。

表2 退火體系

2.2.4 pL-CRISPR.EFS.GFP單酶切

將提取好的質(zhì)粒測濃度及純度，根據(jù)濃度，按表3進行酶切，37℃，30 min。

表3 單酶切體系

2.2.5 回收

將酶切好的質(zhì)粒按OMEGA膠回收試劑盒(D2500-02)中的步驟進行回收。

2.2.6 連接

將稀釋好的雙鏈Oligo產(chǎn)物與回收好的空載體按表4進行連接，25℃連接2 h。

表4 連接體系

2.2.7 轉(zhuǎn)化

提前準備好冰盒，從-80℃取出DH5α感受態(tài)細胞，置于冰上解凍。將連接產(chǎn)物加入感受態(tài)細胞中(體積比不低于1∶10)，輕彈混勻，冰浴30 min。準備42℃水浴鍋，將冰浴好的混合液置于其中熱擊90 s，向其中加入400 μL不含抗生素的LB培養(yǎng)基，混合均勻，置于37℃恒溫搖床，180 r/min，45 min。將其放于離心機中離心，條件3 500 r/min，5 min。棄400 μL上清，將剩余100 μL吹打混勻。將菌液均勻涂布于含抗性的LB固體培養(yǎng)基上，37℃，倒置培養(yǎng)過夜。

2.2.8 挑選陽性克隆

準備好無菌50 mL離心管及含氨芐抗性的液體LB培養(yǎng)基及含單菌落的平板。取5 mL培養(yǎng)基加入離心管中，從板子上選取幾個單菌落，用無菌的小槍頭挑取單菌落置于離心管中。

2.2.9 搖菌

標號，置于搖床中，搖至菌液渾濁。

2.2.10 陽性克隆鑒定

鑒定陽性克隆所用的引物如表5所示。將渾濁的菌液按表6體系及表7的反應程序做菌液PCR鑒定。

表5 菌液PCR體系

表6 菌液PCR體系

表7 PCR反應程序

a2～4重復進行，共36個循環(huán)，每4個循環(huán)降低2℃，退火溫度將從68℃將至52℃

將鑒定正確的菌液送測序。

3 結(jié)果

3.1 空載體單酶切凝膠成像結(jié)果

提取的空載體濃度為540 ng/μL、A260/280為1.85，按照表3單酶切體系進行酶切，酶切產(chǎn)物進行電泳，結(jié)果如圖1所示，回收所需片段。

圖1 M：1000 Marker，1：pl-CRISPR.EFS.GFP單酶切電泳結(jié)果

3.2 菌液PCR凝膠成像結(jié)果

將挑取的單菌落菌液進行Touchdown PCR，結(jié)果如圖2所示，菌液PCR可見大小約300 bp條帶，初步判斷：挑取的五個菌落均為陽性克隆。

圖2 M：2000marker；1-5：pL-CRISPR.EFS.GFP-CCKAR不同克隆的PCR結(jié)果

3.3 公司測序結(jié)果

將菌液PCR結(jié)果正確的菌液送至武漢擎科生物技術(shù)有限公司進行測序，結(jié)果顯示：靶序列成功插入到pL-CRISPR.EFS.GFP(圖3、4紅色框起來的部分)。

圖3 pL-CRISPER.EFS.GFP-CCKAR測序圖

由公司給出的測序結(jié)果可知，檢測KO載體的陽性克隆結(jié)果是準確的。

圖4 pL-CRISPER.EFS.GFP-CCKAR測序峰圖

4 討論

CCKAR是一種G蛋白偶聯(lián)受體，可以被CCK激活。肥胖是2型糖尿病的主要誘發(fā)因素，CCK通過CCKAR的介導對中樞系統(tǒng)的攝食、飽感具有調(diào)節(jié)作用[9]。CCKAR基因的功能喪失可能在肥胖小鼠中誘發(fā)糖尿病。研究發(fā)現(xiàn)，具有 Otsuka Long-Evans Tokushima fatty(OLETF)的大鼠是天生的CCKAR基因敲除型大鼠，而OLETF的特征就是高血糖癥、高胰島素血癥和肥胖[1]。理解不同CCKAR激活的上游及下游信號通路調(diào)控胰腺細胞的其他性能，可用于識別有偏好的CCKAR配體，為以后開發(fā)新的抗糖尿病藥物提供幫助。

基于Crispr/cas 9系統(tǒng)的特殊性，即插入片段在20 bp左右，目的片段PCR擴增鑒定陽性克隆并不可行。在此實驗鑒定中，設(shè)計正向引物位于BsmB I酶切位點的上游300 bp處、反向引物是構(gòu)建載體的Oligo 2，當為陽性克隆時，可以擴增一個約300 bp的帶，當為陰性克隆時無法擴增。利用此技術(shù)，成功構(gòu)建了CCKAR基因的敲除載體，相比于傳統(tǒng)構(gòu)建載體方法更省時省力。

在基因工程中，基因表達載體的構(gòu)建是一個非常重要的實驗步驟。實驗可以通過載體將靶序列轉(zhuǎn)運到真核細胞中并將細胞基因組中的靶序列進行基因編輯，用到的載體含有GFP標簽，將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)染到細胞中，其是否表達可很明顯地看出。新構(gòu)建的KO載體可以方便后續(xù)驗證設(shè)計出的sgRNA的活性及是否脫靶，如果將其包裝成慢病毒非常適合常規(guī)細胞系的建立。