利用CRISPR/Cas9技術構建大鼠CCKAR敲除載體

劉驚濤，李知宗，林顯光，陳恒玲

(中南民族大學 生物醫學工程學院/腦認知國家民委重點實驗室/醫學信息分析及腫瘤診療湖北省重點實驗室，武漢 430074)

1 膽囊收縮素A受體與CRISPR/Cas9系統工作原理

1.1 膽囊收縮素A受體

膽囊收縮素(Cholecystokinin，CCK)由腸I細胞分泌，CCK可通過內分泌、旁分泌、自分泌和神經分泌等多種形式調節多種細胞功能[1]。研究提示，CCK可能與糖尿病的發病存在密切關系[1]。在胰島中，CCK可以通過膽囊收縮素A受體(Cholecystokinin A receptor，CCKAR)來調控胰腺中各個細胞的功能。大量事實證明，CCKAR基因與動物的日采食量和平均日增重有明顯關聯。Takiguchi通過研究發現，CCKAR基因能維持動物體內的血糖濃度[2]。膽囊收縮素A型受體基因與幻聽相關[3]，膽囊收縮素A型受體與人群膽道癌及膽石癥易感性有一定關系[4]。

1.2 CRISPR/Cas9系統工作原理

CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)被稱為規律成簇間隔短回文重復序列。Cas9是CRISPR相關核酸酶，CRISPR/Cas9是最新出現的一種由gRNA指導的、利用Cas9核酸酶對靶向基因進行編輯的技術。CRISPR系統主要依賴crRNA和tracrRNA來對外源DNA序列進行特異性降解。crRNA通過堿基互補配對，與tracrRNA結合，形成tracr/crRNA復合物。此復合物引導核酸酶Cas9蛋白與crRNA互補配對的序列靶位點剪切雙鏈DNA。CRISPR/Cas9系統由于其突變效率高、制作簡單、成本低，被廣泛應用于基因組的精確修飾，是一種具有廣闊應用前景的基因改造分子工具[5-7]。研究使用的載體為pL-CRISPR.EFS.GFP(載體信息見ADDGENE :57818)。

2 實驗部分

2.1 實驗材料

BsmbⅠ限制性核酸內切酶(美國Thermo Scientific公司生產)、CCKAR Oligo序列(武漢Tsingke公司生產)、T4 DNA連接酶(武漢淼靈生物公司生產)、pL-CRISPR.EFS.GFP(實驗室提供)、5× Annealing buffer(上海Beyotime公司生產)、質粒提取試劑盒(美國OMEGA公司生產)、DH5α感受態細胞(武漢Tsingke公司生產)、PCR儀(美國Veriti公司生產)、抗生素(中國Bioshap公司生產)、電泳槽和電泳儀(美國Bio-rad公司生產)、凝膠成像系統(英國SYNGENE公司生產)、恒溫搖床(美國Thermo Scientific公司生產)。

2.2 實驗方法

2.2.1 pL-CRISPR.EFS.GFP質粒提取

按照OMEGA質粒提取試劑盒(D6950-01)中的提取方法進行pL-CRISPR.EFS.GFP質粒的提取。

2.2.2 設計oligo

使用CRISPR設計工具得到guide RNA，用軟件根據堿基互補配對原理得到兩條Oligo DNA。實驗使用的CCKAR基因的單鏈Oligo DNA如表1。

表1 CCKAR基因的Oligo 序列

2.2.3 Oligo退火

將設計好的CCKAR基因的兩條Oligo按照表2的退火體系進行退火，退火條件為95℃，10 min；95℃～45℃，每2 min降1℃；45℃～16℃，每1 min降1℃。退火之后形成雙鏈Oligo。將退火后的產物用水按照1∶100進行稀釋備用。

表2 退火體系

2.2.4 pL-CRISPR.EFS.GFP單酶切

將提取好的質粒測濃度及純度，根據濃度，按表3進行酶切，37℃，30 min。

表3 單酶切體系

2.2.5 回收

將酶切好的質粒按OMEGA膠回收試劑盒(D2500-02)中的步驟進行回收。

2.2.6 連接

將稀釋好的雙鏈Oligo產物與回收好的空載體按表4進行連接，25℃連接2 h。

表4 連接體系

2.2.7 轉化

提前準備好冰盒，從-80℃取出DH5α感受態細胞，置于冰上解凍。將連接產物加入感受態細胞中(體積比不低于1∶10)，輕彈混勻，冰浴30 min。準備42℃水浴鍋，將冰浴好的混合液置于其中熱擊90 s，向其中加入400 μL不含抗生素的LB培養基，混合均勻，置于37℃恒溫搖床，180 r/min，45 min。將其放于離心機中離心，條件3 500 r/min，5 min。棄400 μL上清，將剩余100 μL吹打混勻。將菌液均勻涂布于含抗性的LB固體培養基上，37℃，倒置培養過夜。

2.2.8 挑選陽性克隆

準備好無菌50 mL離心管及含氨芐抗性的液體LB培養基及含單菌落的平板。取5 mL培養基加入離心管中，從板子上選取幾個單菌落，用無菌的小槍頭挑取單菌落置于離心管中。

2.2.9 搖菌

標號，置于搖床中，搖至菌液渾濁。

2.2.10 陽性克隆鑒定

鑒定陽性克隆所用的引物如表5所示。將渾濁的菌液按表6體系及表7的反應程序做菌液PCR鑒定。

表5 菌液PCR體系

表6 菌液PCR體系

表7 PCR反應程序

a2～4重復進行，共36個循環，每4個循環降低2℃，退火溫度將從68℃將至52℃

將鑒定正確的菌液送測序。

3 結果

3.1 空載體單酶切凝膠成像結果

提取的空載體濃度為540 ng/μL、A260/280為1.85，按照表3單酶切體系進行酶切，酶切產物進行電泳，結果如圖1所示，回收所需片段。

圖1 M：1000 Marker，1：pl-CRISPR.EFS.GFP單酶切電泳結果

3.2 菌液PCR凝膠成像結果

將挑取的單菌落菌液進行Touchdown PCR，結果如圖2所示，菌液PCR可見大小約300 bp條帶，初步判斷：挑取的五個菌落均為陽性克隆。

圖2 M：2000marker；1-5：pL-CRISPR.EFS.GFP-CCKAR不同克隆的PCR結果

3.3 公司測序結果

將菌液PCR結果正確的菌液送至武漢擎科生物技術有限公司進行測序，結果顯示：靶序列成功插入到pL-CRISPR.EFS.GFP(圖3、4紅色框起來的部分)。

圖3 pL-CRISPER.EFS.GFP-CCKAR測序圖

由公司給出的測序結果可知，檢測KO載體的陽性克隆結果是準確的。

圖4 pL-CRISPER.EFS.GFP-CCKAR測序峰圖

4 討論

CCKAR是一種G蛋白偶聯受體，可以被CCK激活。肥胖是2型糖尿病的主要誘發因素，CCK通過CCKAR的介導對中樞系統的攝食、飽感具有調節作用[9]。CCKAR基因的功能喪失可能在肥胖小鼠中誘發糖尿病。研究發現，具有 Otsuka Long-Evans Tokushima fatty(OLETF)的大鼠是天生的CCKAR基因敲除型大鼠，而OLETF的特征就是高血糖癥、高胰島素血癥和肥胖[1]。理解不同CCKAR激活的上游及下游信號通路調控胰腺細胞的其他性能，可用于識別有偏好的CCKAR配體，為以后開發新的抗糖尿病藥物提供幫助。

基于Crispr/cas 9系統的特殊性，即插入片段在20 bp左右，目的片段PCR擴增鑒定陽性克隆并不可行。在此實驗鑒定中，設計正向引物位于BsmB I酶切位點的上游300 bp處、反向引物是構建載體的Oligo 2，當為陽性克隆時，可以擴增一個約300 bp的帶，當為陰性克隆時無法擴增。利用此技術，成功構建了CCKAR基因的敲除載體，相比于傳統構建載體方法更省時省力。

在基因工程中，基因表達載體的構建是一個非常重要的實驗步驟。實驗可以通過載體將靶序列轉運到真核細胞中并將細胞基因組中的靶序列進行基因編輯，用到的載體含有GFP標簽，將構建好的載體轉染到細胞中，其是否表達可很明顯地看出。新構建的KO載體可以方便后續驗證設計出的sgRNA的活性及是否脫靶，如果將其包裝成慢病毒非常適合常規細胞系的建立。