灘羊羊毛與毛囊發育相關生物學機制研究進展

馬麗娜，于 洋，馬 青

（寧夏農林科學院動物科學研究所，寧夏銀川750002）

灘羊是寧夏回族自治區主養品種，是國家二級保護地方優良品種，是一種獨特的裘皮用綿羊品種。對灘羊品種特性的研究大多關注利用傳統遺傳學方法理論及生命體形態發生學分析裘皮形成的主要影響因素，以及如何進一步進行對灘羊品種進行合理利用及品種保護等，而對灘羊卷曲毛發表型的研究鮮少。隨著分子生物學不斷發展，對灘羊毛發卷曲特性的研究逐漸從傳統遺傳學轉變為單個基因對該性狀的影響，通過分析某個基因或多個基因的多態性，研究該基因與其調控性狀之間的關聯性。

1 灘羊裘皮特征

灘羊裘皮，又名二毛皮，是指羔羊出生后約35 d屠宰所得的皮張。此時，毛股長約7 cm，毛股的彎曲數達到5個以上，波浪狀，自然彎曲下垂[1]。灘羊裘皮具有潔白如玉、晶瑩剔透的外觀、良好的柔軟性以及保暖性。

灘羊毛屬于異質毛，被毛由有髓毛、無髓毛、兩型毛組成，還有極少部分羊含有少量干死毛[2]。灘羊不同時期被毛的類型不同，初生期時灘羊被毛為兩型毛，毛長約4.5 cm，毛短而彎曲。而到35 d后的二毛時期，絨毛長出皮膚，被毛的類型由絨毛和兩型毛組成，此時毛長約7 cm，毛股的彎曲達到5～6個以上[3]。二毛裘皮根據不同比例的被毛類型形成不同類型的圖案，根據圖案的類型將灘羊裘皮分為軟大花型、串子花型、綠豆絲花型。其中，綠豆絲花型絨毛含量最少（30%～40%），串子花型次之（50%左右），軟大花型絨毛含量最多（60%以上）[4]。

2 羊皮膚結構

羊的皮膚對保護體內器官組織不受到外部環境破壞以及保持體內水分的平衡具有重要作用[5]。羊的皮膚內部組織結構從外到里由羊的表皮、真皮以及皮下結締組織三部分組成。羊的表皮由生發層和表皮層兩部分組成。真皮層主要由毛囊層和真皮下的網狀層兩個大部分組織構成。真皮下分布著具有疏松的結締組織，毛囊層實際上就是疏松的結締組織，是由毛囊以及皮脂腺、汗腺等毛囊附屬結構組成[5]。毛囊是一個形狀類似于口袋狀的組織結構[6]，從外到內依次由外根鞘（outerrootsheath，ORS）、伴侶層（companionlayer）、內根鞘（innerrootsheath，IRS）與毛干（hairshaft）構成。其中，外皮、皮質、髓質組成了毛干結構。而赫胥黎層（huxleylayer）、亨勒層（henlenslayer）以及內根鞘外皮構成一個完整的內根鞘結構。內根鞘包圍毛干，是決定毛干的生長與分化所必需的結構[7]。毛球內部里面包含著稠密的真皮纖維細胞，它們內陷深入形成一個口袋狀的結構，稱之為毛乳頭（dermalpapilla，DP）。毛乳頭是一個高度特殊的結構，是毛囊發育調控的中心結構，負責信號的發送與接收[8-9]。毛乳頭是由存在于毛囊基底部的真皮源性細胞（即真皮毛乳頭細胞）組成[10]，在有關毛發毛囊的形成以及毛囊發育的周期循環中具有關鍵的作用。依據毛囊的形態和結構可以將其分成初級毛囊、次級毛囊兩類。一般羊的初級毛囊形成于胎兒時期60～85 d，初級毛囊數目較少，結構上初級毛囊直徑較大，具有2個皮脂腺、汗腺以及立毛肌等完整的毛囊附屬結構；而羊的次級毛囊形成于胎兒時期75～115 d，次級毛囊數目較多，而在結構上直徑較小，不具有完整的毛囊屬結構，有且僅有一個皮脂腺，并且次級毛囊多數圍繞初級毛囊分布[11-12]。

毛囊毛纖維的發育與毛囊的生長息息相關，毛囊各部分角蛋白基因表達各不相同，有著復雜的生物學過程[13]。毛囊也是一個高度循環的結構，由毛球的生長與衰退控制，主要分為3個時期，毛發生長早期（anagen，生長期）、毛發生長中期（catagen，退行期）和毛發生長晚期（telogen，休止期）。在毛發生長的不同周期，毛發特異性角蛋白表達不同，影響毛纖維生長發育和纖維性狀。毛囊是調控毛發生長的皮膚附屬器官，對于毛發彎曲形狀的形成具有重要作用[14]。毛囊是一種特定的微型器官，具有周期性生長的能力，是組織再生研究的有效模型。毛發的形狀、類型和顏色等性狀不僅在胚胎發生期間確定，而且在每個毛發生長周期中重復確定。灘羊二毛皮特性是在灘羊生長發育的特殊時期（出生到30 d）表現的性狀，在灘羊胚胎期已被奠定，其形成可能與胚胎期毛囊與毛纖維發育相關基因的表達及其調控有關[15]。趙正偉等[16]研究發現，軟大花羔羊毛纖維鱗片結構與山羊絨相似，保暖性優于串子花羔羊毛，抗粘連性較串子花羔羊差，二毛期灘羊的增重與毛股彎曲數呈負相關；串子花羔羊毛纖維強度優于軟大花羔羊。楊佐青[6]應用同位素標記相對和絕對定量（iTRAQ）蛋白質組學方法，對灘羊、內蒙古蘇尼特羊、中衛山羊和新吉細毛羊的皮膚蛋白進行差異表達研究，發現K34和K83可能與灘羊羊毛粗細及彎曲度呈相關性。牛姝等[17]研究發現，KRT71基因在毛囊內根鞘特異表達，并且在綿羊不同部位毛發彎曲與基因表達量呈正相關，進一步證明KRT71基因的表達與毛發彎曲相關。李向龍等[18]研究發現，灘羊初生期側部彎曲數與初生期側部毛長、二毛期側部彎曲數間均存在極顯著正相關；二毛期側部毛長與側部彎曲數呈極顯著正相關。兩型毛、絨毛的毛纖維直徑標準差（FDSD）與毛纖維直徑變異系數（CVFD）間均呈極顯著強正相關；兩型毛絨毛的平均纖維直徑（MFD）與FDSD均呈極顯著正相關；絨毛MFD與絨毛CVFD呈極顯著正相關；絨毛MFD和平均纖維曲率（MFC）間呈極顯著負相關。白玲榮等[19]建立及優化了灘羊羊毛蛋白質雙向電泳圖譜體系，為后續灘羊羊毛的差異蛋白質組學研究建立條件。趙國順等[20]建議融合蛋白質組、基因組、轉錄組、代謝組等的組學，將從整體的角度研究組織器官功能和代謝的狀態。路立里等[21]發現，羊毛彎曲與毛囊中細胞的不對稱分裂、毛纖維中正副皮質的雙邊排列、不同角蛋白的不對稱組成及角質化過程等相關。楊佐青等[22]通過雙向電泳技術獲得較高分辨率的灘羊4個不同生長時期皮膚雙向電泳圖譜，共獲取19個差異蛋白點，質譜成功鑒定出15個蛋白點，其中發現1號、3號和10號點的14-3-3蛋白σ亞型、9號點為膜聯蛋白A2、16號點為角蛋白25、18號點為微管蛋白α鏈，可能與灘羊皮膚生長調控有關。楊佐青等[23]通過iTARQ技術對內蒙古蘇尼特羊、中衛山羊和新吉細毛羊分別與灘羊皮膚蛋白比對獲得的差異表達蛋白進行分析，推測出14-3-3蛋白σ亞型在灘羊進化過程中與其二毛裘皮形成具有一定的關聯性，KRT25、KRT34和KRT85可能與灘羊毛股彎曲和特定花穗形狀的形成有關，TCHH在灘羊毛股彎曲的形成中具有重要的調控作用，KAP6和KAP11.1基因可能參與灘羊羊毛纖維直徑調控。李亞超等[24]采用iTRAQ技術及LC-MS/MS的研究方法，對初生期和二毛期串子花型灘羊的皮膚樣品進行蛋白質鑒定和篩選，發現初生期與二毛期裘皮共檢出2 599個蛋白，其中初生期65個差異蛋白高表達，二毛期有122個差異蛋白高表達；發現HSPA4L蛋白可能對灘羊串子花型裘皮二毛期毛發的彎曲程度有一定的作用；ApoA1可能在灘羊串子花型裘皮二毛期毛囊的發育以及羊毛的彎曲形成中起到重要作用；GF-1因子可能與灘羊串子花型裘皮二毛期毛囊及毛干的快速發育相關。陳永宏等[25]采用iTRAQ技術及LC-MS/MS蛋白質組學研究方法，對串子花型、軟大花型、綠豆絲型及其他不規則形花穗裘皮蛋白質進行鑒定和篩選，4類花穗型裘皮共檢測出2 886個蛋白，其中有135、142、113個差異蛋白分別存在于軟大花型與串子花型、綠豆絲型與串子花型、其他不規則形與串子花型3個對比組中。對有表達差異的蛋白進行分析，發現膜聯蛋白與血管內皮生長因子可能與軟大花型毛股形成相關，KAP3和KAP6可能與灘羊串子花型毛股結構相關。和東遷等[26]研究發現，羊毛的性狀受多種因素的影響，如基因的變異、編碼蛋白結構的多樣性或者蛋白翻譯后修飾以及外部因素的影響等。

3 羊皮膚轉錄組學研究

隨著RNA-seq技術在生命科學的不同領域的發展與應用，皮膚轉錄組層面已經廣泛的使用RNA-seq技術進行科學研究。但是，國內外對于動物皮膚轉錄組學的研究內容涉及的相對較少。Yue等[27]使用IlluminaHiseq2000平臺對細毛羊皮膚進行了轉錄組測序，共有22 164個功能基因被注釋，并將其歸類到25類218條信號通路中，其中與毛囊發育相關的信號通路有17條，為綿羊遺傳和功能基因組的研究提供良好的平臺。Nie等[28]利用以生產地毯毛的羊為研究對象，通過對胎兒皮膚進行高通量測序，發現全局性改變的lncRNA（上調36個，下調26個）、mRNAs（上調228個，下調225個）和80個表達差異的新轉錄本，通過功能富集后發現了WNT、EDAR、BMP等幾個關鍵信號和一系列的lncRNA對初級毛囊的誘導具有重要意義。Gao等[29]以克什米爾山羊為研究對象，用胎兒60、120 d、初生期的克什米爾絨山羊的皮膚進行高通量轉錄組測序，在胎兒60 d與胎兒120 d轉換組內篩選出1 024個差異基因，胎兒60 d與初生期轉換內篩選出1 801個差異基因，胎兒120 d與初生期轉換期內無顯著差異表達的基因。進一步分析發現，Wnt、TGF-β和Notch家族的成員在毛囊的分化和成熟過程中具有重要作用。

Kang等[30]用RNA-seq技術對1月齡、48月齡灘羊皮膚共鑒定出51 215個轉錄本，對前100表達量高的轉錄本的通路分析表明，這些通路對毛發或絨毛的發育相關，篩選出600個差異表達基因，檢測到差異表達基因分別與信號、信號肽、二硫鍵、糖蛋白和分泌項有關，進一步分析表明，金屬硫蛋白亞型3在灘羊皮膚中上調，提示其可能與中國灘羊卷毛的構象有關。劉玉芳[31]利用抑制性消減雜交技術（SSH）在灘羊兩個生長階段中共鑒定出67個差異表達基因，最終獲得20個（包括KRT71和KRT83）與毛發生長相關基因。對差異miRNA進行GO和KEGG分化其主要富集到MA信號通路與AMPK信號通路等與卷曲毛發生長相關的通路。KRT71基因啟動子區甲基化修飾是影響該基因在灘羊兩個時期的差異表達的重要調控方式；Mir432和cap1抑制KRT83基因的表達，可能是調控灘羊被毛卷曲形成的重要原因[31]。何玉龍等[32]等通過高通量測序技術對成年灘羊和小尾寒羊皮膚毛囊中的miRNAs進行分析，在灘羊與小尾寒羊中共篩選到63個上調和16個下調的差異miRNAs。通過對差異表達miRNA進行富集分析，發現其靶基因主要參與細胞組分、代謝過程、細胞進程催化活性等；而KEGG通路分析表明，在內吞作用、糖酵解、糖異生和嘌呤代謝等信號通路上顯著富集。上述結果表明，在兩個品種的皮膚組織中篩選的差異miRNA可能通過調節其靶基因而參與調節羊皮毛囊發育的過程。

4 展望

由于目前科研工作者們在灘羊裘皮的研究中投入的科研經歷尚不足，因此，有關灘羊裘皮性狀遺傳研究的相關報道還相對較少，需要進一步的完善。

目前，未找到國內外對于胚胎后期以及胎兒早期灘羊皮膚轉錄組學的研究，期望本文對于灘羊皮膚毛囊發育轉錄組學研究提供一定的參考價值。未來灘羊裘皮性狀研究可從以下2點入手：（1）針對我國灘羊二毛皮的獨特性，采用全基因組關聯分析和胚胎期轉錄表達組分析等組學技術，揭示二毛皮卷曲度密切相關的關鍵基因與變異；（2）結合胚胎期皮膚毛囊動態發育過程，構建二毛皮發育的調控網絡，解析二毛皮卷曲性狀形成機制，進而較為全面的闡述二毛皮生長發育的遺傳機制，為優質灘羊的二毛皮性狀選育提供準確可靠的分子育種標記。未來，將會有更多影響羊毛彎曲、毛囊生長發育因子及調控機制被發現和闡明，可為動物種質資源的保護和利用提供參考。