NRG1對七氟醚麻醉致認知功能障礙保護作用的研究

翁洪亮，李興達，李鳳利，王明敬，徐以燕

(臨沂市中心醫院，山東 臨沂 276400)

0 引言

術后認知功能障礙主要是指麻醉后患者定向力、抽象思維、記憶力等功能出現障礙，部分患者還可伴有社會活動減退現象，直接影響其社交能力，成為圍術期最為多見的中樞神經系統的并發癥[1]。其中七氟醚屬于臨床常用的吸入型麻醉藥物，其安全性已被臨床公認，且手術期間可穩定患者的血流動力學，并減低肌松藥物的劑量，促進患者盡快蘇醒[2]。但隨著七氟醚的廣泛運用，臨床關于患者麻醉后躁動以及認知功能障礙發生率較多的報道隨之增多，但七氟醚可對神經系統發揮保護功效，但臨床學者關于其對認知能力的影響仍存在較大爭議[3-4]。隨后臨床發現NRG1(神經調節蛋白1)對七氟醚麻醉致認知功能障礙的保護作用存在一定影響，但目前相關報道較少，本文對此展開實驗，闡述如下。

1 資料與方法

1.1 動物與分組

選擇清潔級成年的30 只SD 大鼠，依據隨機雙盲法分成三組各10 只，其中正常組：大鼠僅僅尾靜脈注射生理鹽水；模型組：3%七氟醚麻醉大鼠；NRG1 組：大鼠尾靜脈注射10μg/kg 的NRG1，持續一周。

1.2 方法

創建認知功能障礙大鼠模型：麻醉前，大鼠禁飲禁食，放入透明麻醉吸入箱進行吸入麻醉，將麻醉箱一側孔與麻醉機(德國Drager 公司，DragerFabius 型)連接，另一側孔與多功能監測儀(美國GE 公司，solar8000M 型)相連，密切關注流出氣體的麻醉濃度。所有大鼠給予1.5%異氟醚，維持性吸入2h，使麻醉箱維持30%氧濃度。麻醉手術組大鼠在吸入箱內接受麻醉后，快速轉移至預充相同氣體以及吸入麻醉藥的大鼠面罩內，實施麻醉與手術，對其右側股動脈進行插管，并連接多功能監護儀，清除腹部皮膚毛發，常規消毒后，給予腹正中切口，執行腹腔探查術，分別檢查其腸道、肝、腎等重要器官，手術時長2h 左右。術中密切關注大鼠動脈血壓、心率等體征，并提供腹腔加溫生理鹽水滴注補液及保溫處理。分別在術中0.5h、1h、2h 收集其動脈血實施血氣分析。術中嚴格遵守無菌操作，術后選擇青霉素鈉50u/g 進行腹腔注射，1 次/d，預防感染，等待傷口完全愈合、拆線。

Morris 水迷宮實驗：水迷宮直徑設置成130 cm，深度30 cm，水溫度23℃左右，平臺高28 cm，置于第Ⅳ象限。實驗前24h 將大鼠投入水中，使其適應實驗環境條件。整個實驗期間水迷宮外的參照物均維持不變，且要求操作者每次實驗均站在同一位置，實驗時長7d。

定位定航實驗：將大鼠從不同象限面向池壁放入水中，觀察其在120 s 內尋找平臺的時長，即是逃避潛伏期。若大鼠120 s內未尋找到平臺，潛伏期計成120s。所有大鼠反復3 次，每次間隔30 s，最后統計平均值。空間探索實驗：實驗第7d，撤走平臺，隨意選擇一個象限將大鼠放入水中，觀察大鼠120s 內游泳的軌跡。

實驗第7d 后，各組大鼠均經股動脈放血，放在室溫下自然凝固，隨后以2500 r/min 進行離心操作，時間控制在10 min，收集血清，放在-80℃冰箱保存備用。將放血休克后的大鼠快速斷頭取腦，置于冰上，利用彎眼科鑷將腦組織正中失狀縫位置左右皮質打開，得到海馬組織，放入EP 管內，存放在-80℃冰箱保存備用。

1.3 觀察指標

選擇4%多聚甲醛妥善固定海馬組織，時間24h，分別選擇95%、85%、75%酒精依次脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，蘇木精染色，自來水清洗，選擇1%鹽酸酒精分化，伊紅復染，最后梯度酒精脫水，二甲苯透明，利用中性樹脂固定，選擇光學顯微鏡，仔細觀察海馬組織病理變化。

利用ELISA 法測定大鼠海馬組織中Aβ(β淀粉樣蛋白)及APP 的表達，選擇100μg 海馬組織，分別加入蛋白酶抑制劑、烷基硫酸鈉，裂解勻漿，置于4℃條件下，以12000 r/min 離心，時間10 min，取上清液，嚴格遵照Aβ及APP 試劑盒說明書進行測定。

利用實時熒光定量PCR 法測定Aβ及APP mRNA 的表達，依據trizol 試劑盒要求提取肺組織中總RNA，并檢測總RNA純度，將獲得的RNA 利用逆轉錄試劑盒合成CDNA，最后利用Realtime PCR 擴增，其結果選擇2-ΔΔCt 法分析。

western blot 法測定Aβ及APP 蛋白表達，勻漿肺組織，加入適量RIPA 裂解液，離心操作后收集上清液，得到總蛋白。按照BCA 試劑盒說明書要求檢測蛋白濃度。蛋白上樣，實施凝膠電泳，后濕法轉PVDF 膜。一抗溶液孵育，4℃過夜；二抗溶液中室溫孵育1-2 h。取膜漂洗，加入ECL 曝光液，在凝膠成像系統中曝光。

表1 三組Morris 水迷宮實驗結果的對比

1.4 統計學處理

2 結果

2.1 三組Morris 水迷宮實驗結果的對比

NRG1 組的游泳速度、逃避潛伏期、穿越平臺次數、停留時長、游泳距離與其他三組相比差異顯著(P＜0.05)。見表1。

2.2 三組NRG1、Aβ 以及APP mRNA 的對比

NRG1 組的NRG1、Aβ、APP mRNA 與其他三組相比差異顯著(P＜0.05)。見表2。

表2 三組NRG1、Aβ 以及APP mRNA 的對比

3 討論

術后認知功能障礙作為麻醉后極為常見的嚴重并發癥，臨床癥狀以記憶力降低、注意力不集中、精神錯落等現象為主，部分患者可維持數周甚至數年，直接影響患者的日常生活以及機體健康[5]。一旦出現后，可延長患者治療周期以及住院時長，不僅給患者機體健康帶來危害，同時可能增加家庭經濟負擔，受到醫療界重點關注[6]。

臨床經研究發現[7]，年齡、手術、麻醉以及患者身體狀況等因素均是引發術后認知功能障礙的主要原因，尤其是在全身麻醉中，其麻醉藥物可對患者大腦意識、學習記憶能力造成不同程度的抑制，才可滿足手術需要的麻醉深度，但術后藥物的清除程度可能難以快速促進患者大腦神經功能恢復，甚至可能造成β淀粉樣堆積，促進神經元凋亡。Xiong 等學者曾開展實驗[8]，選擇小鼠作為觀察對象，分別給予七氟醚麻醉進行干預，結果發現其出現顯著的認知缺陷，經分析發現七氟醚能夠對NGF 進行干擾，使膽堿能變性，進而引發認知功能障礙。而認知功能障礙的病理特征以Aβ水平升高為主，而NRG1 作為神經分裂癥上的易感基因，尤其是在癲癇或者阿爾茲海默病等精神疾病上，可發揮一定的神經保護效果，因此臨床推測其對麻醉造成的認知功能障礙也存在保護作用，同時可抑制Aβ表達，但尚未有相關報道證實[9]。本文對此展開實驗，從結果中看到：NRG1組的游泳速度、逃避潛伏期、穿越平臺次數、停留時長、游泳距離與其他三組相比差異顯著(P＜0.05)。NRG1 組的NRG1、Aβ、APP mRNA 與其他三組相比差異顯著(P＜0.05)，提示NRG1 組水迷宮檢查結果更優，同時可改善NRG1、Aβ、APP mRNA 表達水平。其中Aβ作為認知功能障礙中常見的標志物，其與神經功能損害存在一定相關性，而手術、麻醉、炎癥反應等均可直接影響機體中Aβ的代謝，促進其生成，因此Aβ在認知功能障礙的發生中具有重要意義。Yu 等學者[10]曾選擇胃部手術患者作為觀察對象，對比術后認知功能障礙者與未發生者的血清Aβ水平，發現前者水平更高于后者，進一步證實了發現隨著Aβ水平的增加，患者神經功能的損傷隨之加重，甚至引發認知功能障礙。而NRG1 作為表皮生長因子蛋白，可刺激ErbB 受體酪氨酸激酶，進而控制神經遞質傳導，直接影響大腦生理功能、中樞神經系統發育。由于NRG1 中具備表皮生長因子樣核心基團，可促進軸突生長、神經元遷移、突觸產生。另外海馬以及皮層的神經活動與大腦學習記憶存在密切關聯性，因此NRG1 可控制多類神經遞質產生，并在海馬神經以及皮層網絡活動上具備重要意義，最終影響大腦記憶能力[11]。從本文研究結果中看到，NRG1 不僅能夠對鼠神經進行保護，同時還可改善認知功能障礙現象，其機制與抑制Aβ堆積有關。

綜上所述，NRG1 運用于七氟醚麻醉認知功能障礙中效果突出，對認知功能進行保護，為后續臨床防治提供指導價值。