三氧化二砷對人三陰性乳腺癌細胞株MDA-MB-231 教化單核細胞的影響

季秋蘭，丁景弦（通信作者）

1 南昌大學第四附屬醫院老年科 （江西南昌 330003）；2 南昌市第三醫院放療科 （江西南昌 330025）

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤，現階段，其發病率仍呈持續升高的趨勢。在歐美等發達國家，乳腺癌占女性惡性腫瘤的25%～30%[1]；與西方國家不同，我國乳腺癌的發病率呈雙峰分布，第一高峰為40～45歲，相較于多發于婦女絕經后的西方國家提早了10～15年[2-3]。

腫瘤免疫治療相關研究是當前研究的熱點，有望通過激活機體自身免疫系統徹底清除腫瘤細胞[4]。然而，臨床實踐顯示，腫瘤免疫治療反應性差異很大，最主要的原因可能是患者腫瘤微環境中存在較強的免疫抑制狀況，使浸潤的T 淋巴細胞識別腫瘤細胞的能力下降[5]。腫瘤微環境中腫瘤相關的巨噬細胞（tumor associated macrophage, TAM）具有抑制腫瘤免疫的作用，其豐度是乳腺癌獨立的不良預后因素[6]。

TAM 由單核細胞經替代途徑活化、分化而來，通常具有M2型免疫表型，表達CD163。巨噬細胞集落刺激因子1（macrophage colony-stimulating factor 1，CSF1）是目前已知的參與單核細胞向M2型巨噬細胞活化、分化的細胞因子[7]。本課題組前期研究發現，激素受體陰性乳腺癌細胞株MDAMB-231 CSF1的表達水平明顯高于激素受體陽性乳腺癌細胞株MCF-7。文獻[8]報道，三氧化二砷（arsenic trioxide，As2O3）能逆轉三陰性MDA-MB-231的激素受體狀態從而減弱其惡性生物學行為。本研究擬探討As2O3對人三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞教化單核細胞定向分化為M2型TAM的影響及其機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞

人三陰性乳腺癌細胞株MDA-MB-231原購自美國ATCC細胞庫，U937細胞株由復旦大學馬端教授饋贈，GFP-PURO雙標穩定表達U937細胞系及RFP-NEO 雙標穩定表達MDA-MB-231細胞系由本課題組前期建立。

1.1.2 藥物和試劑

RPMI 1640細胞培養液、胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素（Gibco 公司），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），As2O3（Sigma 公司），CSF1酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（Invitrogen），RNA 提取試劑盒、逆轉錄試劑盒及實時熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒（日本TaKaLa 公司）。

1.1.3 儀器

CO2培養箱購自Thermo 公司，Transwell 板購自康寧公司，實時熒光定量PCR 儀購自Bio-Rad 公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養

將含5×104個MDA-MB-231細胞的完全培養基200 μl 接種于96孔板中，24 h 后吸出培養上清，向其中分別加入100 μl 無血清培養基或濃度分別為2、4、6、8、10、12 μmol/L 的As2O3培養液100 μl，每組3個復孔，繼續培養24 h 后收集上清， 以200 g 離心5 min 除去細胞碎片，收集上清放于-80 ℃冰箱中保存待行ELISA 檢測。

1.2.2 CSF1濃度檢測

本實驗利用Invitrogen 公司CSF1 ELISA 試劑盒檢測不同培養上清中單核細胞分化相關細胞因子CSF1濃度，實驗操作按照產品說明書操作流程進行。

1.2.3 MDA-MB-231細胞與U937細胞共培養

將5×105個U937細胞接種于Transwell 板（24孔，孔徑5 μm）上室中，下室種不同處理組5×105個MDA-MB-231細胞，共培養24 h 后于熒光顯微鏡下觀察空白對照組、不同濃度As2O3處理組MDA-MB-231細胞對U937細胞趨化運動的影響。

將不同實驗組中5×105個MDA-MB-231細胞接種于Transwell 板（6孔，孔徑0.4 μm）上室中，下室種5×105個U937細胞，共培養24 h 后檢測空白對照組、不同濃度As2O3處理組MDA-MB-231細胞對U937細胞CD163基因表達的影響。

1.2.4 CD163的表達檢測

針對共培養24 h 后的U937細胞與不同處理組MDAMB-231細胞，利用總RNA 提取試劑盒Trizol 按實驗流程提取總RNA，利用TaKaLa 試劑盒反轉錄得到cDNA，利用逆轉錄實時熒光定量PCR 檢測不同處理組U937細胞CD163表達的差異。GAPDH 作為內參基因，擴增片段引物系列見表1，PCR 反應條件參考既往發表文獻[7]。

表1 引物系列及其產物片段長度

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 不同濃度As2O3處理對MDA-MB-231細胞表達CSF1的影響

0、2、4、6、8、10、12 μmol/L 的As2O3處理MDA-MB-231細胞24 h 后培養上清中CSF1的濃度分別為（266±28）、（242±28）、（204±12）、（127±10）、（94±13）、（82±22）、（54±17）ng/L，不同處理組間CSF1濃度比較，差異有統計學意義（F=54，P＜0.01），見圖1。

圖1 ELISA 檢測As2O3 對MDA-MB-231 細胞培養上清中CSF1 濃度的影響

2.2 不同濃度As2O3處理MDA-MB-231細胞對共培養體系中U937細胞趨化的作用

0、6、12 μmol/L 的As2O3處理MDA-MB-231細胞24 h 后共培養體系中U937細胞遷移能力隨著濃度遞增而減弱，見圖2。

圖2 在共培養體系中不同濃度As2O3 處理MDA-MB-231 細胞對U937 單核細胞株趨化作用的差異

2.3 不同濃度As2O3處理MDA-MB-231細胞對共培養體系中U937細胞CD163表達的影響

0、2、4、6、8、10、12 μmol/L的As2O3處理MDA-MB-231細胞24 h后共培養體系中U937細胞CD163 mRNA的表達水平分別為100.0%、83.5%、73.8%、48.3%、36.5%、17.6%、8.7%，不同處理組間CD163 mRNA表達水平比較，差異有統計學意義（F=120，P＜0.01），見圖3。

3 討論

三陰性乳腺癌約占女性乳腺癌的16%，目前尚未發現特定治療靶點，總體預后較差。TAM 是腫瘤微環境中的重要細胞組成成分，主要通過促進新血管生成和瘤旁炎癥反應等來發揮其在腫瘤生長、轉移中的作用。研究發現，三陰性乳腺癌組織中TAM 豐度較高，體外實驗也表明三陰性乳腺癌細胞株MDA-MB-231誘導單核細胞株U937分化為TAM 的能力較強[6-7]。As2O3具有誘導分化作用，文獻[8-9]報道其能誘導人乳腺癌細胞 MDA-MB-231 ERα 啟動子中的CpG 島發生去甲基化，恢復表達雌激素受體。

圖3 不同濃度As2O3處理MDA-MB-231細胞24 h 后對共培養體系中U937細胞表達CD163的差異

本研究通過Transwell 共培養系統，利用相關細胞生物學和分子生物學實驗手段發現As2O3能下調CSF1的表達，從而減弱其教化單核細胞分化、活化為M2型巨噬細胞的能力。這為三陰性乳腺癌患者的治療提供了新的實驗依據，后續有望開展相關臨床研究，進一步探討As2O3治療三陰性乳腺癌患者的安全性和有效性。