CX3CR1及小膠質細胞在視網膜退行性疾病中的研究進展

祁玉麟，賈茜鈺，葉河江

0引言

視網膜退行性疾病如視網膜色素變性(retinal pigmentosa，RP)、年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration，ARMD)、糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)等是一類致盲性眼病，雖然發病機制和臨床特點各不相同，但感光細胞進行性凋亡和視網膜色素上皮細胞的功能障礙及損失是其共有的病理改變，最終導致患者失明。有研究表明CX3CR1及其配體CX3CL1參與此類疾病的病理生理過程，而趨化因子受體CX3CR1在視網膜中由小膠質細胞特異性表達，在調節小膠質細胞活化及神經元存活中發揮重要作用[1]。由于CX3CR1信號多種功能和作用機制復雜，其在不同病理情況下發揮神經保護和神經毒性作用的關系尚不清楚。本文就趨化因子受體CX3CR1的結構、功能及其與小膠質細胞在視網膜退行性疾病的作用研究做如下綜述。

1 CX3CR1結構與生理功能

趨化因子的功能行使主要由趨化因子受體介導，參與細胞的黏附與遷移[2]。CX3CR1是由1 065個核苷酸編碼、355個氨基酸組成的功能蛋白[3]，受CX3CR1基因編碼的G蛋白偶聯受體，含有7個跨膜區的結構形態。人類CX3CR1的編碼基因在染色體上位于3p21，具有2個單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphisms，SNP)即V249I(rs3732379，纈氨酸替換為異亮氨酸)和T280M(rs3732378，蘇氨酸替換為甲硫氨酸)[4-5]。G蛋白能與CX3CR1胞內區的相應結構產生結合，可引發相關的磷酸化反應，參與相應的信號轉導[6-7]。全身的單核細胞、樹突細胞和自然殺傷細胞可普遍表達CX3CR1[8-9]，但這些細胞在正常情況下很少能夠通過血腦屏障進入健康大腦中，因此認為CX3CR1表達的唯一來源是小膠質細胞。

CX3CR1是趨化因子CX3CL1的特異性、高親和力受體[10-11]，視網膜作為中樞神經系統的延伸，研究發現CX3CR1受體在虹膜、睫狀體、視網膜色素上皮、視網膜小膠質細胞以及Müller細胞上有表達[12]。CX3CR1通過與CX3CL1的結合介導細胞的遷移和黏附，對流動的單核細胞、T細胞、NK細胞的黏附作用強[13-14]。研究發現在多種疾病中CX3CL1-CX3CR1與小膠質細胞關系密切，提供了視網膜神經元和小膠質細胞之間的細胞間信號傳導方式，已成為多種疾病新的治療介入點。

2 CX3CR1與小膠質細胞

CX3CR1作為趨化因子受體在機體的神經組織、淋巴組織及髓細胞系等系統均有表達[15-16]，而在中樞神經系統及視網膜中則由小膠質細胞特異性表達。小膠質細胞是在中樞神經系統(central nervous system,CNS)和視網膜中的一類膠質細胞，作為免疫監控及免疫效應細胞，同時在視網膜發育階段對維持視網膜的生長及神經發生穩定具有關鍵作用[17]。在正常情況下，小膠質細胞呈現靜息狀態，通過宿主監測、組織修復以維持自身平衡穩定。當出現代謝異常、損傷、炎癥時小膠質細胞被激活，活化的小膠質細胞發生顯著形態改變為“阿米巴樣”[18]，進而發揮作用。

CX3CR1在小膠質細胞表面高度表達，CX3CL1則表達于健康視網膜神經元及細胞。有研究表明，小膠質細胞可通過CX3CL1-CX3CR1信號通路影響光感受器細胞形成，缺失CX3CR1信號通路可導致纖毛蛋白分布的改變和外節段無法延伸，最終致視錐細胞受損[19]。

CX3CL1-CX3CR1對小膠質細胞的作用表現出疾病及器官特異性，在不同的疾病模型或致病機制中，表現出不同作用甚至相反。一方面，在外傷、炎癥等急性損傷性疾病中，CX3CL1-CX3CR1誘導小膠質細胞激活，促使其遷移到受損部位，發揮吞噬細胞的毒性作用，引起分泌多種炎癥因子包括NO、TNF-α、IL-1β等造成神經元損傷[20]；另一方面，在某些退行性疾病中CX3CL1-CX3CR1表現出可抑制小膠質細胞而發揮對神經元的保護作用[21]。隨著對趨化因子及其受體的發現及功能研究，發現CX3CL1-CX3CR1與小膠質細胞的活化之間存在著十分密切的關系，可作為抑制小膠質細胞活化的一個環節或靶點。在許多視網膜疾病模型中，維持適當水平的信號可能具有重要的致病性，如CX3CR1信號降低與疾病轉歸惡化和小膠質細胞活化增加有關。因此，CX3CL1-CX3CR1與小膠質細胞的功能要在具體的疾病模型中進行具體分析。

3 CX3CR1與小膠質細胞在視網膜退行性疾病中的作用

3.1視網膜色素變性RP是人類嚴重的視力障礙最常見的原因之一，致病基因突變、細胞應激、炎癥反應和視網膜重塑等與RP的發病機制有關，其結果是感光細胞的丟失凋亡，導致視力喪失和夜盲[22]。在RP眼中小膠質細胞受凋亡光感受器的吸引，從視網膜內層移行至外層，吞噬變性的光感受器胞質成分，并且激活的小膠質細胞也釋放一些毒性物質，損害周圍正常神經元[23]。

有研究發現視網膜小膠質細胞活化導致RP視網膜嚴重受損[24]，其證實CX3CR1缺陷導致外核層(outer nuclear layer，ONL)中活化小膠質細胞的積累增多并且光感受器脆弱性增加。rd10小鼠視網膜的小膠質細胞激活發生在神經退行性變之前，表現為CX3CR1，Aif1，Irf8等小膠質細胞特異性基因表達上調[25]。在CX3CR1敲除rd10小鼠中觀察到ONL變薄，表明CX3CR1缺乏導致額外的視桿細胞損失，也加劇了視錐細胞的形態變化和功能喪失。CX3CR1敲除的rd10小鼠視網膜中小膠質細胞向感光細胞層的浸潤顯著增加，并加速感光細胞凋亡和萎縮；缺乏CX3CR1的小膠質細胞顯示吞噬作用增強，增加炎癥細胞因子和小膠質細胞激活標志物的表達；當外源性CX3CL1給藥則可增加rd10視網膜中CX3CL1-CX3CR1的信號傳導，有效減少小膠質細胞浸潤、吞噬作用和激活，改善光感受器變性的結構和功能特征[26]。CX3CL1-CX3CR1可抑制rd10視網膜中的小膠質細胞活化，并且CX3CR1缺陷導致額外的小膠質細胞活化對光感受器存活發揮額外的神經毒性作用。有研究者采用孕酮類似物諾孕酮(Norgestrel)治療可上調CX3CL1-CX3CR1信號RNA水平，進而調節視網膜小膠質細胞的活化和遷移來保護神經元[27]。而采用RP的視網膜光損傷模型鼠，研究指出其光感受器細胞CX3CL1的表達明顯上調，小膠質細胞的活化、CX3CL1的上調程度與視網膜神經細胞的損傷程度呈正相關性[28]。視網膜光損傷模型大鼠中視網膜CX3CR1和CX3CL1蛋白IOD值、蛋白相對表達量均明顯高于對照組，表明在視網膜損傷過程中有一定作用[29]。視網膜光損傷過程中CX3CL1與CX3CR1對小膠質細胞發揮誘導活化的作用，趨化后者生成TNF-α、IL-1β等炎癥因子，誘導過度炎癥反應，造成神經損傷，進而加重光感受器細胞凋亡。

最近有研究表明，通過CX3CL1-CX3CR1信號通路小膠質細胞還可影響光感受器的形成，CX3CR1信號通路的缺失可導致纖毛蛋白分布的改變和外節段延伸的失敗并最終導致視錐細胞的受損[30]。而CX3CL1是維持小膠質細胞穩態的調節器，在沒有損傷的情況下防止小膠質細胞的過度活化，同時在炎癥發作期間促進小膠質細胞和星形膠質細胞的活化[31-32]。小膠質細胞的激活與光感受器的損傷有著直接聯系，通過CX3CL1-CX3CR1信號通路調控小膠質細胞活性可能成為阻止神經元細胞損傷和提高存活的一種治療方式。

3.2糖尿病視網膜病變作為世界范圍內的嚴重致盲眼病，DR的發病率日趨增長。DR在臨床上可分為兩種階段：(1)早期非增生性階段(non-proliferative diabetic retinopathy，NPDR)，其特征是血管滲透性增加，視網膜微血管系統變性，基底膜增厚以及視網膜毛細血管中的周細胞喪失；(2)晚期增生性階段(PDR)則涉及病理性新生血管形成、玻璃體出血以及視網膜脫離[33]。研究指出在DR出現微血管障礙前神經元細胞就已經出現病理改變[34]，表現為視網膜神經節細胞凋亡增加、神經膠質細胞反應性增高和小膠質細胞活化等[35]。研究顯示在早期DR的NPDR階段視網膜活化的小膠質細胞可在尚未出現微血管病變及神經元壞死之前檢測出來，進而表明小膠質細胞在DR早期已經能夠產生相應作用[32]。

在早期DR中CX3CR1調控小膠質細胞功能形態變化。研究使用CX3CR1基因敲除Ins2糖尿病小鼠發現視網膜中小膠質細胞網狀結構的紊亂，表現出無規則排列，呈現典型活化形態，而視網膜中還未出現微血管病變和神經元的壞死；小膠質細胞的活化時間明顯縮短，顯著加重網狀結構破壞，同時CX3CR1基因敲除后小鼠視網膜不斷堆積數量眾多的巨噬細胞，為小膠質細胞活化遷移的重要標識[36]。Ins2AkitaCX3CR1敲除小鼠在20周齡時即表現視網膜神經節細胞(retinal ganglion cell，RGC)層神經元細胞數量減少，小膠質細胞數量增加和星形膠質細胞反應降低[37]。CX3CR1缺失的情況下小膠質細胞反應失調導致了DR神經元的炎癥介導性損傷。CX3CR1缺失的DR小鼠中全身炎癥導致纖維蛋白原外滲區域中增殖的小膠質細胞呈現強烈血管周圍聚集，并誘導小膠質細胞和星形膠質細胞中炎癥因子IL-1β表達[38-40]。

CX3CR1缺失加速DR視網膜血管的病理改變，增加視網膜細胞的凋亡，同時激活局部小膠質細胞或巨噬細胞浸潤[40]。CX3CR1在DR模型中高度表達發揮對神經元保護，其抑制小膠質細胞活化的效應也被證實。有研究指出增生性DR組患者玻璃體腔的CX3CL1表達水平較對照組顯著上升，伴隨血管內皮細胞出現自身顯著加強的趨化性，表明在增生性DR中視網膜新生血管的形成有CX3CL1-CX3CR1參與[41]。DR中喪失CX3CL1-CX3CR1信號可引起小膠質細胞活化失調，進而破壞全身炎癥過程中視網膜的血管完整性，因此調節CX3CR1信號傳導可能是減輕糖尿病視網膜組織病理變化的相關替代方法。

3.3年齡相關性黃斑變性ARMD是一種致盲性的眼底疾病并已成為發達國家老年人失明的主要原因[42]。人類CX3CR1的編碼基因在染色體上位于3p21，具有2個SNP為V249I和T280M[5]。有研究對ARMD患者CX3CR1兩個SNP的等位基因的關聯程度進行檢測分析發現其可能與ARMD的易感性相關[43-44]。對827例ARMD患者進行基因分型發現ARMD的風險增加與CX3CR1兩個等位基因的多態性顯著相關[45]。在攜帶M280等位基因的ARMD患者眼中，黃斑區CX3CR1水平比周圍視網膜低，但在健康人眼中未檢測到類似差異[46]，證實CX3CR1的多態性可能是ARMD發病的危險因素之一。

在ARMD患者眼底視網膜變性及CNV發生部位可發現大量小膠質細胞的聚集，積聚的小膠質細胞則表達CX3CR1陽性，并在玻璃膜疣中發現CX3CR1沉積物，故CX3CR1陽性小膠質細胞的積聚可能與ARMD玻璃膜疣形成、光感受器變性及新生血管形成有關[47]。新生血管性ARMD患者視網膜中CD8+T細胞上CX3CR1的表達顯著降低[48]。采用ARMD的經典動物模型CX3CR1基因敲除小鼠模型進行研究，有研究觀察發現活化后的小膠質細胞形態出現腫脹變性，導致在其病變部位呈現出玻璃膜疣樣改變，光感受器外節盤膜出現脫落[49]。通過將視網膜中表達CX3CR1的小膠質細胞募集至病變部位，并與外層視網膜細胞的相互作用對視網膜變性起到調節作用[50]。在CX3CR1基因敲除鼠視網膜中檢測到數量眾多的活化小膠質細胞，小膠質細胞CX3CR1依賴性的堆積在視網膜內發揮作用與實驗性CNV的惡化相關，疾病發展也因此進一步加重。隨著CX3CR1基因敲除鼠年齡增長，其視網膜中可見局灶性的視網膜色素上皮(RPE)及光感受器的萎縮，與ARMD的改變類似[51]。也有研究指出[52]敲除CX3CR1基因的小鼠表現出視網膜退行性改變如萎縮的光感受器細胞，而濕性、進行性ARMD的典型改變尚未被發現。當CX3CR1基因敲除鼠暴露在光損傷的環境中，發現視網膜更容易在慢性光損傷的刺激下呈現ARMD病變，TNF-α等炎癥因子的含量也因此上升[53]。缺乏CX3CR1可能引發視網膜RPE及光感受器的萎縮，病變情況可在光損傷等外界因素的影響下呈現進一步加重的趨勢。在ARMD動物模型中，CX3CR1具有抑制小膠質細胞活化，保護神經元作用。故對CX3CR1與小膠質細胞展開大量深入研究，已成為ARMD治療的重要靶點。

3.4青光眼青光眼是一類導致不可逆性失明的神經退行性疾病，患者視力逐漸喪失終致失明[54]，其病理特征在于視網膜神經節細胞及其軸突逐漸消亡，視網膜神經纖維層變薄和視盤凹陷[55],具體病因和發病機制尚不清楚。盡管眼內壓升高是其發病主要因素之一，但與免疫機制有關的因素在青光眼發病機制中也起著關鍵作用[56]。小膠質細胞作為中樞神經系統及視網膜中的免疫細胞，在青光眼的人類和動物模型的研究中均顯示出小膠質細胞是青光眼中神經炎癥過程持久化的重要因素[57]，其長期過度活化導致神經元細胞變性，尤其是RGC的喪失[58]。神經膠質細胞的活化在疾病早期引起青光眼損害的發展[59]，在青光眼動物模型中僅在眼壓升高后2h小膠質細胞表達明顯增加并早于RGC死亡[60]。

在慢性青光眼和高眼壓的動物模型中早期小膠質細胞即在視網膜、視神經、視路中激活并重新分布[61-62]。在短暫性眼內壓(IOP)升高的青光眼模型小鼠中，CX3CR1缺失會增強小膠質細胞的神經毒性作用，進而引起更為廣泛的RGC丟失，提示CX3CR1可在IOP升高下抑制小膠質細胞的激活[63]。在慢性青光眼模型DBA/2J小鼠中，CX3CR1基因敲除后發現視神經頭早期的小膠質細胞增生與神經病理的晚期嚴重程度顯著相關[64]。研究表明CX3CR1缺失可增加RGC數量的早期下降并加劇RGC軸突功能障礙，同時CX3CL1信號喪失促進營養不良的RGC產生，加劇軸突運輸功能障礙。缺乏CX3CR1可導致DBA/2J小鼠視網膜髓樣細胞中一氧化氮合酶2(NOS-2)的表達增加，引起Ccr2+單核細胞/巨噬細胞浸潤的增強并選擇性地加劇軸突運輸功能障礙[65]。因此研究CX3CR1對青光眼RGC的作用機制可成為疾病新的治療介入點。

4結語

綜上，CX3CR1及其配體CX3CL1引導的信號通路對小膠質細胞進行調控以發揮對神經元及視網膜細胞組織的效應作用。CX3CL1-CX3CR1的作用機制復雜多樣，在不同疾病、不同作用途徑中其效應作用不同甚至相反。不斷深入研究CX3CR1功能和其對視網膜小膠質細胞的調控和功能重建，有助于干預小膠質細胞活化后的促炎、自身免疫、自噬等效應作用，保留免疫監視和保護視網膜的有益功能。對于CX3CR1及其配體CX3CL1的多角度不斷探索研究為視網膜退行性病變提供重要的研究方向與思路，也為防治視網膜退行性疾病提供了新的治療研究靶點。