葉酸與不良生育的相關研究

胡浩梅，楊華

葉酸（維生素B9）是人體內重要的營養素之一，其參與DNA 的合成和甲基化，幫助氧化損傷修復、參與蛋白質代謝，另外還與維生素B12 協同促進紅細胞的生成及成熟。因此，體內葉酸攝入不足或代謝異常均會造成多種發育相關基因和通路的調控異常，進而導致多種疾病及妊娠婦女生育不良。在我國有不良生育史的妊娠婦女占10%～15%。不良生育主要包括稽留流產、復發性自然流產、宮內死胎及各種胎兒畸形等。此外，我國每年新生缺陷兒高達80 萬～120 萬人，是出生缺陷發生率較高的國家。近年來，葉酸是否是導致不良生育的原因成為研究熱點。目前許多研究表明葉酸攝入不足、吸收障礙或代謝異常與某些不良生育有關，故本文就葉酸與不良生育相關性研究進展進行綜述。

1 葉酸的轉運和吸收

葉酸是水溶性B 族維生素，是促進人體健康的一種重要維生素。主要存在于綠葉蔬菜、水果、豆類、堅果及肉類等食物中，人體不能自身合成，只能從飲食中獲得。飲食中攝取的葉酸主要以多聚谷氨酸鹽的形式存在，必須經過水解才易于被轉運。這是葉酸代謝的第一步，發生在腸黏膜上。葉酸被人體轉運及吸收主要通過3 種轉運體，即質子偶聯葉酸載體、還原葉酸轉運體及葉酸受體，其中葉酸受體α最為重要。有文獻報道，小鼠葉酸受體α 表達異常與神經管缺陷、顱面畸形及心臟發育異常等有重要相關性[1]。

2 葉酸代謝及相關酶基因多態性

葉酸在體內通過二氫葉酸還原酶還原成四氫葉酸（THF），THF 通過5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）催化形成5-甲基四氫葉酸。5-甲基四氫葉酸作為一碳單位的供體不僅參與DNA 的合成，而且做為甲基供體還為同型半胱氨酸（Hcy）再甲基化提供甲基，從而形成甲硫氨酸，進一步參與DNA 甲基化，并參與蛋白質和脂類的合成代謝。

葉酸代謝過程中有多種酶參與，其中MTHFR是最為關鍵且重要的酶。MTHFR 位于1 號染色體1p36.3 位置，研究證實MTHFR 具有多態性，該多態性會導致酶的耐熱性及活性降低進而導致其功能下降。近年研究發現，MTHFR 發生多態突變位點已達到近20 種，其中最重要的突變位點是C677T 及A1298C。MTHFR 677 的突變方式為胞嘧啶變異為胸腺嘧啶，從而使編碼的纈氨酸變異為丙氨酸。MTHFR 677 位點有3 種基因型，分別為CC 型、CT型（雜合突變型）及TT 型（純合突變型）。文獻報道MTHFR 677 多態性基因型分布及其致病性受種族及地區的影響[2]。研究顯示我國人群中CC、CT 及TT型分布頻率分別為33%、44%及23%，且3 種類型對應的酶活性分別為100%、65%、25%[3]。此外，MTHFR 1298 位點的胞嘧啶替代了腺嘌呤，引起其編碼的丙氨酸替代了谷氨酸，造成酶活性降低。MTHFR 1298位點有3 種基因型，分別為AA 型、AC 型（雜合突變型）及CC 型（純合突變型）。文獻報道在我國人群中AA、AC 及CC 型分布頻率分別為67%、28%及3.9%，其對應酶活性分別為100%、82%、60%[3]。另外有文獻報道，中國人同時出現MTHFR 677 TT 型和MTHFR 1298 CC 型的概率僅為1%，其對應的酶活性僅為15%[4]。

葉酸代謝的另一關鍵酶是甲硫氨酸合成酶還原酶（MTRR）。MTRR 基因位于5 號染色體5p15.2～15.3 位置，MTRR 能還原甲硫氨酸合成酶的活性，從而催化產生甲硫氨酸。甲硫氨酸在蛋白質和一碳代謝過程中發揮重要作用，是其代謝過程中的必須氨基酸。MTRR 66 位點是目前研究最多的位點，其腺嘌呤突變為鳥嘌呤，導致MTRR 酶活性降低，進而影響葉酸代謝。研究顯示，漢族人群中MTRR 66 GA 和MTRR 66 GG 分布頻率分別為25.7%和6.6%[4]。

3 葉酸代謝異常導致不良生育

葉酸代謝相關酶的基因多態性造成酶活性下降，影響葉酸正常代謝，干擾人體正常生理代謝過程，可導致多種疾病，其中導致不良生育的相關研究被廣泛報道。

3.1 可導致早期自然流產孔梅等[5]在探討葉酸代謝相關酶基因多態性與胚胎停育的相關性研究中選取114 例有胚胎停育史和125 例正常妊娠婦女為研究對象，分別檢測2 組的MTHFR、MTRR 等位基因及基因型分布情況。結果顯示，胚胎停育組MTHFR C677T 的T 等位基因分布與對照組相比差異有統計學意義（P＜0.05）；胚胎停育組MTHFR C677T 的TT基因型和MTRR A66G 的GG 基因型所占比例高于對照組（P＜0.05）。Logistic 回歸分析顯示，MTHFR C677T 的TT 基因型和MTRR A66G 的GG 基因型是胚胎停育的高危因素，其發生風險分別是對照組的4.12 和4.52 倍。Mo 等[6]在MTHFR A1298C 多態性與中國人群不良妊娠結局關系的研究中發現，MTHFR 1298 基因型分布在中國有地域差異，AA 型分布頻率在中國人口中有由北至南、由東至西的下降趨勢，并得出結論：在中國MTHFR 1298 CC 基因型是造成不良生育基因方面的一個重要因素。Nowak 等[7]在一項波蘭人口復發性流產與MTHFR 基因多態性相關性研究中發現MTHFR C677T 的C 等位基因是防止復發性流產的保護性因素。而復發性流產夫婦中MTHFR 1298 基因型女性和男性組合為AA/AC 者所占比例更高。通過閱讀大量文獻，筆者發現目前研究大多認為MTHFR C677T 的T 等位基因突變是導致復發性流產的重要相關因素，而MTHFR A1298C 及MTRR A66G 基因多態性與復發性流產是否相關意見不同，需進行更深入的研究。

3.2 可導致男性不育研究發現男性MTHFR 基因多態性會造成少弱畸形精子癥，導致男性生育能力降低。蔡麗偉等[8]在男性不育研究中發現不育組MTHFR C677T 中T 等位基因頻率顯著高于對照組，不育組MTHFR C677T CC 型頻率顯著低于對照組，TT 型顯著高于對照組。吳正沐等[9]回顧分析285 對不孕不育夫婦，對男方精液質量、血清Hcy 水平和MTHFR 基因型等資料進行分析，根據Hcy 水平分為高Hcy 組和正常Hcy 組，根據MTHFR 基因型分為TT組和非TT 組，兩兩組合，以非TT 正常Hcy 組為對照組。結果各組精液質量比較差異無統計學意義，TT及非TT 高Hcy 組受精率顯著降低。故認為高Hcy血癥可能會影響輔助生殖技術的受精率。Xie 等[10]在探討MTHFR C677T 多態性與少弱精子癥以及補充葉酸對精液質量影響的相關性研究中發現，低弱精子癥組CT 及TT 基因型頻率明顯高于健康對照組，低弱精子癥組的血清Hcy 水平明顯高于對照組。低弱精子癥患者在補充葉酸3 個月后精子密度顯著增加，尤其是攜帶TT 基因型者增加最明顯。

3.3 可導致新生兒出生缺陷

3.3.1 導致胎兒神經管缺陷（NTDs）NTDs 包括無腦兒、脊柱裂、腦脊膜膨出和腦膨出等。許多研究證實，葉酸缺乏是導致胎兒NTDs 的重要原因之一，補充葉酸可以有效預防NTDs 發生，這點已得到廣泛認可。2006 年MTHFR 是第一個被證實為與先天性脊柱裂相關的遺傳風險因素[11]。Valentin 等[12]認為葉酸缺乏是NTDs 的誘發因素，多項隨機對照試驗表明，高劑量葉酸（4 mg）是預防NTDs 復發的重要因素，低劑量葉酸（0.4 mg）可顯著預防NTDs 的首次發生。其他原因可能增加新NTDs 的發生，如MTHFR多態性、抗癲癇治療、肥胖和糖尿病等。張春紅等[13]在探討中國母親MTHFR 基因多態性與子代NTDs相關性的Meta 分析中得出結論：中國育齡女性MTHFR 基因C677T 多態性是子代發生NTDs 的重要危險因素，基于MTHFR 基因檢測的孕期補充葉酸是降低NTDs 的重要手段。國外最新綜述表明補充葉酸是預防NTDs 的重要方法，但過量補充葉酸可能會導致后代健康異常，如免疫病、自閉癥、脂代謝紊亂等，故基于葉酸檢測后的補充指導很重要[14]。3.3.2 導致胎兒非綜合征性唇腭裂 楊娟等[15]在胎兒非綜合征性唇腭裂發生危險因素的研究中得出結論：孕婦早孕期不良接觸史、感染史、用藥史、葉酸攝入不足、唇腭裂家族史及MTHFR 基因突變是非綜合征性唇腭裂發生的危險因素。印度一項隨機對照研究表明唇腭裂家族史、完全素食、孕婦高齡是唇腭裂的高風險因素，而孕早期補充葉酸不降低唇腭裂發生的風險[16]。郭思遠等[17]研究發現EPHA3 基因、孕早期葉酸攝入及其相互作用與非綜合征性唇腭裂的發病相關。近3 年來此類研究較少，故葉酸代謝異常與非綜合征性唇腭裂是否相關仍需要更深入的研究。

3.3.3 導致新生兒先天性心臟?。ㄏ刃牟。┫刃牟≈饕ǚ渴议g隔缺損、法洛四聯癥和動脈導管未閉等。Xu 等[18]對47 篇文獻進行Meta 分析，結果顯示MTRR、MTHFR 多態性可能是黃種人和白種人發生先心病的高風險因素。Elizabeth 等[19]研究認為血清低葉酸、高Hcy、兒童及其母親中存在基因遺傳多態性是先心病的危險因素。營養和基因的相互作用是可以被改變的一種高危因素。建議補充葉酸和維生素B12 作為先心病的一級預防。還有研究顯示MTRR 66 的AG、GG 基因型與兒童室間隔缺陷有明顯相關性。妊娠婦女MTRR 和MTR 基因均變異時胎兒發生先心病的風險增高[20]。

3.3.4 導致新生兒唐氏綜合征1999 年James 等[21]首次提出葉酸代謝異常與新生兒唐氏綜合征具有相關性。柴鷗等[22]在MTHFR 多態性與唐氏綜合征相關性研究中發現，MTHFR C677T 和A1298C 的基因多態性可能與唐氏篩查高風險有一定關系，攜有C-C或T-C 單體型孕婦篩查唐氏陽性風險的可能性增加。最新研究發現，MTRR A66G 基因位點發生GG突變，可增加女性唐氏兒發生率，如同時伴有MTHFR C677T 位點TT 突變者，其不良生育風險將會進一步升高[23]。

3.4 可導致妊娠期高血壓疾病卜春艷等[24]在MTHFR 基因多態性及孕期補充葉酸與子癇前期發病風險的相關性分析中得出結論，子癇前期發病風險與MTHFR C677T 多態性及補充葉酸有關，在子癇前期高風險的孕婦中進行該基因篩查并依據結果及時補充葉酸有預防子癇前期發生的可能。Seremak-Mrozikiewicz 等[25]對120 例健康孕婦和98 例子癇前期孕婦進行分析發現，MTRR A66G 的GG 基因型突變孕婦體內甲基多巴增高、新生兒出生體質量偏低、胎盤質量高，易導致子癇前期發生。

4 葉酸代謝異常導致不良生育的原因

葉酸代謝異?？墒贵w內Hcy 水平增高，并影響DNA 的甲基化和DNA 的合成及修復，對妊娠期婦女造成不良影響。

4.1 高Hcy 血癥 體內Hcy 主要通過2 條途徑代謝，即再甲基化途徑和轉硫途徑。再甲基化途徑：約50%的Hcy 接受5-甲基四氫葉酸提供的甲基，重新合成甲硫氨酸；轉硫途徑：另約50%的Hcy 通過維生素B6 的催化不可逆生成半胱氨酸和α 酮丁酸。MTHFR C677T 基因突變會導致酶活性降低，影響5-甲基四氫葉酸合成，Hcy 再甲基化障礙，使Hcy 在體內蓄積，引起高Hcy 血癥。MTRR 是葉酸及Hcy 代謝的另一重要因素。MTRR 催化還原MTR，使Hcy再甲基化生成蛋氨酸。MTRR A66G 基因突變致使酶活性下降，Hcy 再甲基化障礙，也可導致高Hcy 血癥。

研究指出，葉酸缺乏和高Hcy 血癥與某些不良妊娠事件有關。孕早期高Hcy 血癥可抑制絨毛膜的形成，減少絨毛的血管數量，減少胚胎的血流灌注，進而導致胚胎著床不良，造成胚胎停育及自然流產。Hcy 水平升高損害血管內皮細胞，增加血栓的風險。孕期血栓是造成自然流產及妊娠高血壓綜合征發生的高危因素。同時，Hcy 對胚胎的毒性也會隨濃度的增加而增大。Hcy 作用于胚胎神經細胞，還可引發先天畸形。資料證實孕期母體Hcy 濃度升高是誘發NTDs 的重要原因。李丹等[26]在Hcy 誘導雞胚NTDs實驗中得出結論：高Hcy 血癥有胚胎毒性并可致NTDs。有研究報道高Hcy 血癥影響胎兒心臟神經嵴細胞生長分化，引起心肌細胞凋亡，導致胎兒先心病的發生。此外高Hcy 引起心臟發育異常還因為Hcy導致細胞高氧化應激，進而對線粒體及DNA 造成損傷，導致基因表達產物異常[27]。高Hcy 血癥對男性生育產生影響是因為高Hcy 可造成精子DNA 損傷，還可誘發其自身氧化應激，損害精子細胞膜，導致精子活力下降[28]。

4.2 DNA 低甲基化DNA 甲基化是指經DNA 甲基轉移酶的催化，將S-腺苷甲硫氨酸提供的甲基添加在DNA 分子上。葉酸是一碳單位供體，葉酸缺乏或代謝障礙可導致全基因組低甲基化。國內一項病例研究發現，NTDs 患兒腦組織全基因組甲基化水平顯著低于對照組，且MTHFR 為TT 型的NTDs 病例表現出顯著的低甲基化[29]。最新研究發現在人類葉酸不足的NTDs 中，印跡基因Mest/Peg1 的甲基化水平降低，同時Mest/Peg1 的mRNA 水平在低葉酸條件下通過低甲基化修飾上調。Mest/Peg1 的上調抑制了Wnt 通路的關鍵成分Lrp6 基因的表達，從而影響神經系統的發育[30]。還有研究表明，DNA 低甲基化通過微小RNA（miRNA）表達失調參與NTDs 的形成[31]。這些都提示DNA 低甲基化可能是NTDs 發生的危險因素。DNA 低甲基化會減緩或中斷組織生長發育，通過影響胚胎DNA 和蛋白質的合成，造成胚胎停育、自然流產及胎兒畸形。DNA 低甲基化，DNA 穩定性降低，DNA 斷裂、染色體分離和重組變異，這是造成唐氏綜合征的原因。此外，DNA 低甲基化對精子也有重要影響，其可導致精子數量減少，造成男性不育[9]。

4.3 賴氨酸去甲基化酶（KDM6A）KDM6A 位于X 染色體短臂11.3，是H3K27me3 的特異性去甲基化酶，可以催化H3K27me3 去甲基化，促進基因的表達，在胚胎發育過程中起重要調控作用。高軍等[32]在動物實驗中發現，低葉酸環境中DNA 雙鏈斷裂增加，KDM6A 表達減少，導致DNA 雙鏈修復基因KU70/80的表達降低，引起DNA 斷裂修復異常，進而導致NTDs的發生。目前相關研究還比較少，這為我們研究葉酸缺乏導致NTDs 的病因研究提供了新思路。

4.4 組蛋白修飾組蛋白修飾是表觀遺傳調控的重要組成部分，包括甲基化、乙?；?、磷酸化和泛素化等。組蛋白修飾水平與腦組織發育和維持正常神經系統功能密切相關。在胚胎發育過程中組蛋白修飾起重要調節作用。魯峰剛等[33]在NTDs 鼠中葉酸干預與組蛋白H3K27me3 表達關系的研究中發現，在葉酸缺乏的NTDs 胎鼠中，H3K27me3 表達水平上調，其下游葉酸代謝相關基因Adcy2 表達也上調；通過葉酸干預，可有效降低兩者表達，從而降低NTDs的發生率。張勤等[34]研究發現在葉酸缺乏的人胚腎細胞中組蛋白H3K79me1 及H3K79me2 水平低于正常培養組，提示葉酸可影響組蛋白修飾從而參與NTDs 的發生。Pei 等[35]在葉酸缺乏誘導組蛋白H2A泛素化導致NTDs 相關基因表達下調的研究中發現，在葉酸缺乏的情況下，H2AK119ub1 表達增高，下調了小鼠胚胎干細胞中神經管關閉相關基因Cdx2、Nes、Pax6 和Gata4 的表達，從而導致NTDs 的發生。補充葉酸可以恢復H2AK119ub1 與神經管關閉相關基因的結合，恢復正常神經管閉合，從而預防NTDs 的發生。Li 等[36]在一個隊列中對神經管關閉基因進行了測序，發現在NTDs 病例中局部腦組織葉酸濃度較低，在神經外胚層細胞中，葉酸不足減弱了Msh6 與組蛋白H3K36me3 的結合，減少了與神經管關閉基因的結合，使錯配修復缺乏，進而導致NTDs的發生。這些研究都提示了葉酸缺乏導致組蛋白修飾改變與NTDs 的發病相關。

5 結語與展望

葉酸缺乏及代謝障礙會導致許多不良生育發生，給家庭及社會造成負擔，故掌握其發病機制非常重要。我國于2017 年已發布圍受孕期增補葉酸預防胎兒NTDs 的指南，明確指出要根據地區、不良生育史、家族史、葉酸代謝酶基因型等的不同做到個性化增補葉酸。盡管目前葉酸與不良生育相關研究較多，但不良生育發病原因復雜，還有許多未知的領域，相信隨著分子生物學研究不斷進展，能更清楚兩者之間的關聯，并能夠發現血清或羊水中相關分子標記物，為預防及早期發現不良生育提供依據，這將是我們未來研究的方向和目標。