間隙連接蛋白43與胎膜早破的相關性

南連玲，穆碗如，張紅，李杰，楊晨晨，湯玲，白玉芳

胎膜早破（premature rupture of membranes，PROM）是指羊膜和絨毛膜在分娩前破裂，是產科最常見的早產原因之一，PROM 發生的危險因素包括感染、雙胎妊娠、陰道炎、環境溫度過高等[1]。PROM可導致新生兒呼吸窘迫綜合征、絨毛膜羊膜炎、胎盤早剝、敗血癥等，95%的妊娠婦女在破膜后4 d 內分娩，沒有發生感染的PROM 患者潛伏期常延長，造成不可避免的早產并給母兒帶來嚴重危害[2-3]。間隙連接通訊是細胞間重要的信息及物質交互形式，間隙連接蛋白43（Connexin43，Cx43）為間隙連接蛋白家族中最常見的一類蛋白，在胎膜中表達并在胎膜完整性維持中有重要作用，探討Cx43 在PROM 發生中的作用可為PROM 的預防及治療提供新思路。

1 PROM 結構基礎

PROM 患者胎膜破口處胎膜由羊膜和絨毛膜組成，羊膜在解剖學上由一層單層立方上皮細胞組成，其厚度約為100 μm，羊膜中的單個膠原纖維的直徑約為50 nm，組織成隨機交織且無規律方向性的松散纖維束[4]。絨毛膜由絨毛膜滋養細胞和分散的成纖維細胞組成，其厚度為300～500 μm。絨毛膜中膠原蛋白形成直徑為4～6 μm 的較厚的纖維束，絨毛膜柔順且可擴展，其堅韌度及拉伸度明顯高于羊膜[5]。在胎膜結構中，相對薄弱的羊膜在受到壓力及炎癥刺激時較絨毛膜更易發生破裂，進而導致胎膜破裂[6]。故若羊膜在臨產前破裂，則會顯著增加PROM 的風險，給母兒帶來嚴重危害。

羊膜上沒有血管和神經，一旦受到損傷，很難自行愈合[7]。羊膜自胎兒側至母體側分別為羊膜上皮層、基底膜、致密層、成纖維層、纖維細胞層、中間層。羊膜上皮層細胞分泌Ⅲ、Ⅳ型膠原、糖蛋白、層黏連蛋白和纖連蛋白，它們形成與基底膜的連接。致密層由成纖維細胞層分泌的Ⅰ型和Ⅲ型膠原形成，Ⅰ型和Ⅲ型膠原與核心蛋白聚糖的結合在羊膜的機械穩定性及促進膠原纖維側向排列中起重要作用，該層存在間充質細胞和巨噬細胞，可及時修復胎膜損傷[8]。中間層形成羊膜和絨毛膜之間的連接，由Ⅲ型膠原、蛋白聚糖和糖蛋白組成，在羊膜腔不足以使絨毛膜和羊膜之間的空隙消失前發揮重要作用[9]。

2 PROM 發病機制探討

胎膜承受壓力過大時，胎膜發生超出容受范圍的延展擴張，進而羊膜層與絨毛膜層分離，若發生絨毛膜破裂，則拉伸彈性差的羊膜進一步擴張，最終導致羊膜破裂發生PROM[10]。若胎膜存在炎癥，則機械壓力增加時更易發生PROM[11]。已有研究表明，特定基質蛋白降解酶以及普遍蛋白水解作用對基底膜的降解是導致足月或未足月PROM 的重要相關因素。膜的機械性能通常與結締組織中膠原蛋白的類型和分布有關。羊膜的機械穩定性是由核心蛋白聚糖決定的，核心蛋白聚糖結合Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白，促進了膠原纖維的側向排列。Mogami 等[8]的研究表明，如果膠原蛋白含量或纖維交聯減少，胎膜的強度會降低，則可能發生PROM。核心蛋白聚糖與纖維膠原蛋白的影響因素均可能使胎膜的拉伸強度及穩定性發生改變，削弱胎膜強度，進而導致PROM 的發生。

覆蓋宮頸處的胎膜存在一個薄弱區域，表現出膠原重塑和凋亡增加的特征，該區域在受到壓力或創傷后容易發生破裂。對該薄弱區域的研究尚未見報道，若能明確該薄弱區域的形成機制，有望為預防PROM 提供有效手段。Richardson 等[12]通過多光子自發熒光和二次諧波成像（SHG）觀察到胎膜對PROM患者胎膜組織進行組織成像，發現了胎膜間的微裂縫，胎膜受損時微裂縫可作為羊水泄漏的通道，機體修補微裂縫失敗也可被視為胎膜破裂的原因之一。尚有研究發現，體內激素水平同樣可影響胎膜強度，如糖皮質激素可增加羊膜中環氧合酶2（COX-2）的表達，削弱胎膜以誘發PROM[13]。炎癥因素是導致PROM 的重要原因之一，Cx43 可調節單核細胞與內皮細胞黏附，影響白細胞參與炎癥級聯反應，Cx43水平下調后，局部炎癥減輕，Cx43 水平升高或可加重局部炎癥反應而導致PROM[14-15]。孕激素可減少Cx43 表達進而可能預防因體內炎癥因素引起的未足月PROM[10]。由此推測，炎癥、胎膜的自我修復能力、妊娠婦女體內激素水平及外在的機械強度增加均可能導致PROM，進而造成早產及一系列母兒并發癥。

3 Cx43 與PROM 相關性探討

PROM 的發病機制復雜，涉及胎膜自身結構、妊娠婦女免疫力及妊娠婦女體內激素水平等。隨著對胎膜的研究越來越深入，分子生物學實驗技術的應用也發現了很多預測PROM 的指標，對基質金屬蛋白酶、間隙連接蛋白、凋亡因子等在PROM 中的研究也越來越多，Cx43 作為細胞間連接、信息及物質交換的重要蛋白，在胎膜的微裂縫進展及膠原緊密排列中發揮重要作用，可能導致或加快PROM 的發生。隨著“全面二孩”政策的實施，預防早產及PROM 顯得尤為重要，亟需發現高敏感度、高特異度的臨床檢測指標。

3.1 Cx43 的基本結構Cx43 是最常見的縫隙連接蛋白，長度為43 ku。Cx43 由內質網合成，在反高爾基體內形成六聚體結構，在細胞膜上由6 個亞單位的跨膜蛋白形成半通道結構，其氨基端和羧基端均位于細胞內，2 個胞外環負責與其他細胞膜上的半通道結構進行信息交互及物質交換，1 個胞內環參與細胞通透性的調節。Cx43 蛋白發揮各種作用的核心是由胞質羧基端（CT）的序列和功能決定的，CT 包含多種蛋白結合位點，參與調節細胞黏附功能、細胞骨架、細胞間形成半通道結構等作用[16]。CT 的長度及構成因間隙連接蛋白種類及功能不同而有所不同，而細胞膜上的各類間隙連接蛋白有結構相似的同源結構，故表達不同連接蛋白的相鄰細胞也可以形成功能通道，以保證細胞間縫隙連接通訊的正常功能[17]。

3.2 Cx43 與妊娠的發生、發展相關細胞間連接通訊在細胞的增殖、分化及凋亡中均起著重要作用，最重要的成員Cx43 在人體廣泛存在[18]。Cx43 在胚胎干細胞分化、受精卵著床和隨后的胎兒發育過程中至關重要，Cx43 的表達減少可導致復發性流產的發生[19]。Shin 等[20]在豬卵母細胞復合物的成熟過程中，受精卵、2～4 細胞期、8～16 細胞期和桑葚胚中檢測到大量的Cx43 轉錄物，并發現Cx43 基因敲除可顯著降低囊胚發育質量和囊胚內細胞總數，導致胚胎質量下降。Cx43 在卵母細胞的發育和成熟過程中也有不可或缺的作用。Cx43 是卵泡發育的所有階段中在顆粒細胞中表達最豐富的縫隙連接蛋白，卵丘細胞依賴于縫隙連接為卵母細胞提供少量的營養物質，以支持卵母細胞成熟[21]。Liu 等[22]發現體內雌激素濃度越高，Cx43 基因和蛋白的表達水平越低，可能干擾子宮內膜狀態，影響胚胎的正常著床。由此可見，Cx43 在妊娠發生及妊娠初期都有重要作用，目前Cx43 在產科領域研究甚少，若能發現Cx43 在妊娠發生、發展中的具體作用機制，可有望為預防妊娠期疾病及母兒并發癥提供有力手段。Cx43 是子宮平滑肌細胞的主要縫隙連接蛋白[23]。Ou 等[24]在大鼠中發現機械拉伸可導致Cx43 水平明顯增高，而孕激素的存在會阻斷這種增高現象，所以分娩期間子宮肌層中Cx43 表達依賴于低孕酮條件下的子宮肌層拉伸。Cx43 在宮頸中定位于子宮頸間質和肌肉組織，Cx43在宮頸癌組織中低表達，Cx43 過表達可抑制宮頸癌細胞惡性生物學行為[25]。胚胎著床前子宮內膜中Cx43 表達下降利于胚胎著床，Cx43 表達升高可導致體外受精-胚胎移植的失敗[26]。

由此可見，Cx43 在胎膜、子宮肌層、子宮頸組織中均有表達，多項研究證明Cx43 表達水平受到內分泌和機械因素相互作用的調節和協調，Cx43 作為細胞間間隙連接通訊的重要因子，廣泛參與妊娠的發生、妊娠進展及婦產科疾病，受到體內多種因素影響調節，在生理狀態與疾病發生中均有參與，但是其具體作用機制尚不明確，若能明確其在發病機制中的作用，可有效預防疾病發生。

3.3 Cx43 與損傷胎膜修復密切相關在PROM 發生過程中，薄弱的羊膜起著關鍵作用，若羊膜發生破裂，將會顯著增加PROM 的風險。王艷艷等[27]通過免疫組織化學染色PV 法發現Cx43 主要定位于絨毛膜滋養細胞層細胞，羊膜上皮細胞也有少許表達，PROM 患者胎膜中Cx43 水平相比正常產婦降低。Barrett 等[28]建立了受損人工胎膜模型，通過免疫熒光（IMF）共聚焦顯微鏡及SHG 技術觀察到在人工胎膜創傷模型培養168 h 后，Cx43 在胎膜成纖維細胞層表達水平顯著增加，在創傷邊緣的胎膜微裂縫中表達更高，并發現間質細胞與傷口前緣呈90°極化，驅動膠原蛋白的結構發生變化，從而減慢了胎膜創口處的細胞遷移效率，減慢了創口愈合速度。Barrett等[29]發現靶向Cx43 可以防止應變誘導的細胞外基質損傷，并促進胎膜的組織重塑機制，炎癥因素和機械因素的結合可以擾亂胎膜中由Cx43 信號介導的典型的機械轉導過程，對拉伸敏感的CX43/蛋白激酶B 信號通路可因炎癥介質前列腺素E2和基質金屬蛋白酶的增加而激活，進而導致胎膜中膠原降解，增加對促進組織重塑有重要作用的糖胺聚糖的合成，促使胎膜組織結構重塑而導致胎膜正常結構改變。胎兒手術后絨毛膜中Cx43 的過度表達會誘導膠原基質的形態和結構變化，從而可能干擾正常的愈合機制。

3.4 Cx43 與Ⅰ、Ⅲ型膠原密切相關羊膜的強度主要是由Ⅰ、Ⅲ型膠原決定。Cx43 模擬肽Gap27 與Cx43 細胞外環結合，影響Ⅲ型膠原表達；而TATGap19 與細胞質環的L2 結構域結合，改變其與羧基末端尾部的相互作用，影響Ⅰ型膠原表達[30]。Montgomery 等[31]在Cx43 基因局部敲除小鼠皮膚受傷后第7 天發現，Cx43 局部基因被敲除的小鼠Ⅰ、Ⅲ型膠原的基因表達顯著增加。Cogliati 等[32]也在Cx43 基因被敲除的小鼠皮膚中發現，Ⅰ、Ⅲ型膠原的mRNA 表達量在皮膚損傷后7 d 達到高峰，且真皮再上皮化和創面閉合、成纖維細胞增殖和活化、細胞外基質重塑速度均明顯加快，可證實Cx43 能抑制Ⅰ、Ⅲ型膠原水平。王寧等[18]在皮膚組織中發現Cx43表達水平與Ⅰ型膠原水平呈負相關。胎兒手術后AM 中Cx43 的過度表達會誘導膠原基質的形態和結構變化，從而可能干擾正常的愈合機制[33]。說明Cx43 可能通過干擾Ⅰ、Ⅲ型或更多膠原而參與PROM。目前尚無更多證據證實Cx43 在胎膜中是否對Ⅰ、Ⅲ型膠原有同樣影響，尚待進一步研究證實。

4 結語與展望

綜上所述，目前關于預測PROM 的生物學標記物很多，但敏感度和特異度有限，尚需進一步探究具有高敏感度、高特異度的標記物。而Cx43 作為間隙連接蛋白家族的重要成員，對檢測胎膜間隙連接功能有明確特異性。多項研究已證實，Cx43 在胎膜完整性與重塑過程中發揮重要作用，已有學者通過顯微鏡技術觀察到胎膜的細胞結構，并通過免疫染色方法在胎膜細胞中發現Cx43 的表達，這為通過檢測妊娠婦女體內Cx43 水平預測PROM 的提供了理論依據?；陂g隙連接通訊在細胞間連接通訊的重要作用，Cx43 或可作為PROM 的預測指標及治療靶點，改善PROM 患者的母兒預后。然而目前對Cx43參與PROM 的具體機制及表達方式尚不明確，且PROM 病因尚未完全掌握，尚需進一步深入研究。