基于DNA條形碼探究盜條蜂Anthophora plagiata(Illiger,1806)的物種界定*

張丹 牛澤清 吳清濤 達娃 朱朝東**

（1.中國科學院動物研究所動物進化與系統學院重點實驗室；2.中國科學院大學生命科學學院，北京 100000；3.西藏自治區高原生物研究所，西藏 拉薩 850000）

蜜蜂總科物種豐富，分布廣泛，在農林生態系統中具有重要的作用[1-4]。根據Ascher等人統計，目前全世界已被描述的蜜蜂物種超過24000 種[5]。中國目前已記述種類為1432種，還有大量的物種待發現。在物種鑒定和系統發生關系的解決過程中，物種的概念以及物種的界定仍是生物系統學以及分類研究中最基本的問題[6]。甚至對于同一個研究類群，不同的研究人員可能界定物種的標準也有差異。隨著多學科的結合與發展，關于物種概念的爭論與解釋一直存在，尤其是對于近緣種和隱存種的界定問題。

盜條蜂（Anthophora plagiata）中胸背板及腹部體毛顏色差異較大（從灰白色至狐紅色）。在前人的研究中，不同的學者根據體毛顏色的差異將其劃分為不同的物種[1]。根據生物學物種概念，一般認為同一個物種雄性生殖器結構形同。對于雄性物種，可以通過解剖生殖器，根據其結構來判斷是否是相同的種[7]，但對于雌性個體，這種外表特征的變化，例如盜條蜂體毛顏色的變化，在一定程度上很難判斷是種內還是種間變異。

在過去的十幾年中，DNA條形碼技術已發展成為一種成熟的技術，在生物學等相關領域得到廣泛應用，同時也為生物分類學的發展帶來新的機遇[8]。研究者們通過DNA條形碼的方法，發現很多類群存在隱形種，例如對歐洲蝴蝶隱形種多樣性的研究[9]；除了隱存種，通過DNA條形碼技術可以將全變態昆蟲幼蟲和成蟲相聯系，這一方法已在水生昆蟲的鑒定與檢測等方面廣泛應用[10]；DNA 條形碼技術的發展也為蜜蜂總科物種雌雄配對問題找到了一個突破口[11-13]，例如，2010 年Gibbs 等人在對加拿大淡脈隧蜂屬（Lasioglossum）的研究中，利用DNA 條形碼技術對該屬物種進行雌雄配對，為后續該屬的研究奠定了基礎[14]。

本研究中我們結合形態學特征和DNA 條形碼技術，研究盜條蜂（蜜蜂總科：蜜蜂科：條蜂屬）的毛色變異，探討不同毛色的個體是否為同一個物種的問題。

1 材料方法

1.1 標本采集

標本采集時間為2019—2020 年6 月、7 月和8 月，采集地點主要包括西藏自治區（定日縣、聶拉木、普蘭縣、亞東縣）以及青海省（格爾木市）。本研究主要以掃網的方法采集標本，將采集到的標本放入裝有硅膠的凍存管中，并制作干制標本。

1.2 形態學鑒定

本研究中共計檢視22 頭盜條蜂標本。所有檢視標本都儲存在中國科學院動物研究所標本館。本研究所用檢視標本的顯微鏡為：Nikon SMZ1500 檢視標本，并連接Nikon D7000 數碼相機多張拍攝，然后利用Helicon Focus 對照片進行疊加，合成清晰的照片，后期使用Photoshop CS6軟件合成圖版。

1.3 樣本DNA提取、擴增及測序

將所有采集的標本制成針插標本以后，選取其中12頭標本進行分子測序（見表1）。取標本右側中足置于1.5ml 的離心管中加無水乙醇保存，將其帶回實驗室后，測定其一段線粒體細胞色素C 氧化酶亞型I 基因序列（cytochrome oxidase subunit I,COI）。在DNA提取前，加液氮至離心管研磨樣本至粉末狀。本研究使用DNeasy Blood＆Tissue Kit（Qiagen GmbH，Hilden，Germany）試劑盒嚴格按照其說明書要求進行基因組DNA 提取。COI 基因所用引物為C1-J1514 和C1-N2194[15-16]；聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction,PCR）體系為30ul 體系（COI）：10μl ddH2O、15μl Premix TaqTM（LA TaqTMversion2.0plus dye）（TaKaRa）、1ul 單向引物（10μM）、3μl DNA 模板；反應體系如下：94℃解鏈2 分鐘、45℃退火40 秒、72℃延伸1 分鐘（4個循環）、94℃解鏈40 秒、50℃退火40 秒、72℃1 分鐘（35 循環），72℃終延伸6 分鐘。獲取PCR 產物后，經瓊脂糖凝膠電泳（濃度1%）觀察后，將條帶清晰的PCR 原液送至公司雙向測序（測序儀規格：BigDye v3.1,ABI 3730xl DNA 分析儀）。

表1 分子測序樣本信息表

1.4 序列比對、物種界定及系統發生分析

獲得序列以后，將每條序列上傳至NCBI(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgiz)進行初步比對，以確保每條數據都為蜜蜂科物種的序列。之后通過BioEdit［17］使用ClustalW進行比對。由于COI是蛋白質編碼基因，我們使用MEGA 7［18］檢測是否有終止密碼子的存在，并輔以手動調整。

本研究采用ABGD 的方法對物種整理好的序列進行物種界定。將比對好的序列，提交至ABGD［19］在線分析網站（https://bioinfo.mnhn.fr/abi/public/abg-d/），參數設置如下：Pmin=0.001,Pmax=0.1,Steps=50,X=0.5,Nb bins=50,遺傳距離模型為K80。

本研究利用IQ-TREE［20］構建最大似然法系統發育樹（ML），調用內置ModelFinder 計算最佳模型為GTR+I+G，選擇吳氏條蜂Anthophora wuae(Brooks,1988)為外群。

2 結果

2.1 形態學結果

盜條蜂Anthophora(Melea)plagiata(Illiger,1806)

Megilla plagiataIlliger,1806:140,♀.

Apis parietinaFabricius,1793:323.(Homonym).

Anthophora villosaHerrich-Sch?ffer,1840:73,♂.

Anthophora parietinavar.fulvocinereaDours,1869:168,♀,♂.

Anthophora turanicaFedtschenko,1875:10,♀.

Anthophora parietinavar.schenkiiDalla Torre,1877:162.

Anthophora simplicipesMorawitz,1880:344,♂.

Anthophora mlokosewitziRadoszkowski,1884b:24-25,♀.

Anthophora nigripesMorawitz,1887:205,♀.(Homonym).

Podalirius simplicipes semiaterFriese,1897:268,♀.

Anthophora pulcherrimaBingham,1897:532-533,♀,♂.

Podalirius parietinus nigrescensFriese,1897:270,♀.

Anthophora filchneraeFriese,1908:98,♂.

Anthophora khambanaCockerell,1910b:415,♀.

Anthophora khambanavar.atramentataCockerell,1911i:177,♀.

Anthophora pilosellaFriese,1919:278,♀,♂.

Anthophora semenoviKuznetzov-Ugamsky,1927:329.

Anthophora parietina pamiricolaHedicke,1930b:853,♀,♂.

Anthophora khambana chodjanaHedicke,1938:195.

Anthophora parietina baltistanicaHedicke,1940:85.

Anthophora parietina ladakhanaHedicke,1940:86.

Anthophora pulcherrima himalayaensisWu,1982b:413,♀,♂.

鑒別特征：雌體長12mm～16mm；唇基刻點粗大，唇基中央具縱脊；觸角鞭節第一節等長于2～4 節之和；顎眼距寬大于長，長約為寬的2/3；顏面被灰白色或灰黃色或黑色長毛；中胸背板被灰白色或黑色長毛（中胸背板及側板黑毛較多）；足一般被灰白色、灰黃色或黑色長毛，足內側毛黑褐色；腹部背板第一節被灰黃色、或黃褐色或黑色長毛，腹部第2～5 節背板變化極大，灰黃色、黃褐色或狐紅色（詳見圖1）。

圖1 盜條蜂雌性體毛變換示意圖,標尺：A-D：1mm

雄體長10mm～14mm；雄性唇基、上唇均為黃色；后足基跗節內側端部2/3 處具1 齒狀突起；腹部第七背板中央呈半圓形凹陷；雄性同雌性，毛色變化極大，胸部及腹部第一節背板被灰白色、灰黃色、黃褐色或狐紅色長毛，腹部背板2～6 節被灰黃色、或狐紅色長毛；足被灰白色、灰黃色長毛（圖2A-E）；雄性生殖器結構及第7、第8腹板結構見圖2F-H［21-22］。

圖2 盜條蜂雄性示意圖

檢視標本：1 ♀1♂，西藏阿里普蘭縣赤德村（E81.1427,N30.2954），4100m,19-VI-2020,吳清濤，張丹采;6♂，西藏亞東縣上亞東鄉（E88.9300,N27.5035），3724m,30-V-2020,吳清濤，張丹采;1♀8♂,西藏定日縣長所鄉（E87.4925,N28.5273），4109m,2-VII-2020,吳清濤，張丹采;1♀,西藏阿里普蘭縣赤德村（E81.1427,N30.2954），4100m,18-VII-2020,吳清濤，張丹采;1♀,西藏普蘭縣普蘭村（E81.2531,N30.2001），3837m,17-VII-2020,吳清濤，張丹采;1♂,青海格爾木市無極龍鳳宮附近（E94.3679,N35.8887），3709m,28-VII-2020,吳清濤，張丹采;1 ♀，西藏吉隆縣佩枯措附近（E85.5865,N28.7554），4566m，4-VIII-2019,吳清濤，張丹采;1 ♀，西藏聶拉木縣乃龍鄉古城堡附近（E86.3519,N28.7757），3859m,29-VII-2019，吳清濤，張丹采。

采訪植物記錄：Astragalus strictus(勁直黃芪)、Berberis lecomtei（光葉小蘗）、Astragalus adsurgens(斜莖黃芪)。

國外分布：歐洲，中亞。

國內分布：吉林、內蒙古、河北、北京、甘肅、青海、新疆、江蘇、浙江、四川、云南、西藏。

2.2 物種界定及鑒定結果

本研究中我們對采自西藏不同地方的12 個盜條蜂樣本正反向測序，共計獲得COI 序列21 條，通過對序列的比對最后獲得COI 序列的長度為576bp。將序列上傳至ABGD 網站分析，發現“Barcoding gap”存在于0.01-0.014之間，說明該樣本為一個物種。

圖3 利用IQ-TREE基于COI基因構建的ML樹

本研究中，基于COI 基因的ABGD 分析得到了與形態分類同樣的結果，說明對于蜜蜂中的某些類群，毛色并不是一個穩定的形態分類學特征。

致謝

衷心感謝中國科學院動物研究所喬格俠研究員及西藏自治區第二次青藏科考領導小組辦公室尹君老師對本研究的大力支持。