不同濃度明膠水凝膠用于3D生物打印的初步研究

＊賀思 黃漢記 雷丹青

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)研究院 廣西 530021 2.廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院 廣西 530021)

3D生物打印技術(shù)（3D打印），該技術(shù)在矯形外科、脊柱外科、頜面外科、神經(jīng)外科和心臟外科等眾多學(xué)科中都有應(yīng)用[1]。目前用于3D生物打印的水凝膠包括合成化合物，如聚丙烯酰胺衍生物和聚乙二醇，以及天然聚合物等[2]。水凝膠的概念在20世紀(jì)60年代初引起了生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的關(guān)注。從長期來看，水凝膠已經(jīng)得到了很大的改進(jìn)和提高，其在生物醫(yī)學(xué)和制藥方面的應(yīng)用，在過去幾十年里受到了特別的關(guān)注[3]。由MA改性的明膠水凝膠（Gel-MA），因其與其它現(xiàn)有的水凝膠形成的生物材料相比，它在一定程度上滿足了生物功能和機(jī)械可調(diào)性的要求，而且通過使用3D細(xì)胞培養(yǎng)，不僅展示了自然的細(xì)胞外環(huán)境，而且還提供了良好的3D組織結(jié)構(gòu)的可能性，所以Gel-MA受到越來越多的關(guān)注[4]。本項目研究不同濃度的可3D打印的Gel-MA，對其物理化學(xué)及生物學(xué)性能進(jìn)行分析，并初步探討其在3D生物打印中的應(yīng)用價值。

1.材料和方法

(1)主要儀器與試劑

主要儀器：3D生物打印機(jī)器（pro），真空冷凍干燥機(jī)，力學(xué)測試儀（Instron5943），8mW/cm2，365nm的紫外燈（Uvitron International），電子精密天平（梅勒-托利多儀器公司），恒溫培養(yǎng)箱（Forma）等。

主要試劑：MA改性明膠（阿拉丁生化科技），光引發(fā)劑（Irgacure2959），軟骨誘導(dǎo)液[TGF-β1（Perotech）10ng/ml+抗壞血酸（Solarbio）50ug/ml+地塞米松（Solarbio）100nmol/ml+胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒（Solarbio）50mg/ml]等等。

(2)不同濃度明膠水凝膠的制備

參考文獻(xiàn)[5]所述，配制含光引發(fā)劑Irgacure2959質(zhì)量濃度為0.1%的PBS溶液，稱取適量的MA改性后的明膠，溶于PBS溶液中，不斷攪拌，直至完全溶解，配制成一系列相同體積不同濃度的Gel-MA前體液（10%、12.5%、15%、17.5%、20%），把各濃度的Gel-MA前體液滴入直徑為8mm，高為4mm的模具中，用8mW/cm2，365nm的紫外燈照射3～5min[6]，紫外光引發(fā)自由基聚合使水凝膠前體液形成水凝膠，隨后放于冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥后放于-20℃冰箱中保存。

(3)不同濃度的明膠水凝膠的表征分析

①凍干水凝膠的溶脹性能測試

參考文獻(xiàn)[7]所述，將前述Gel-MA用電子精密天平稱量并記錄下原始質(zhì)量W0，然后將干燥的水凝膠置于PBS溶液中，5%CO2，37℃恒溫培養(yǎng)箱中觀察水凝膠的溶脹變化并記錄各個溶脹時間點2h、4h、6h、8h、10h、20h、24h取樣下水凝膠的質(zhì)量Wi，取樣測定過程中，每次取樣后，稱重前用干凈干燥的濾紙拭去水凝膠表面的水分，再進(jìn)行稱量，每組重復(fù)3個樣。水凝膠的質(zhì)量溶脹比計算公式為：λ（W）=（Wi-W0）/W0。

②力學(xué)檢測

參考文獻(xiàn)[8]所述，利用單抽拉伸檢測法和10N負(fù)載能力的負(fù)載單元，將直徑為8mm，高為4mm MA改性的不同濃度的明膠水凝膠放于載樣臺上，設(shè)定壓縮速度為0.5mm/min后用力學(xué)測試儀檢測，每組水凝膠測5個樣品并重復(fù)5次。

③營養(yǎng)液滲透實驗

參考文獻(xiàn)[9]所述，將已經(jīng)制備好的，直徑為8mm，高度為4mm的不同濃度的Gel-MA，完全浸泡在5ml左右的軟骨誘導(dǎo)液中，浸泡時間分別為15min、30min，然后再對其進(jìn)行觀察和拍照。

④濃度為15%的明膠水凝膠進(jìn)行3D打印的初步嘗試

將15%的MA改性的明膠溶液，恒溫37℃下攪拌，直至溶液均一穩(wěn)定。設(shè)置新型微沉積成型平臺，加工溫度為37℃。啟動軟件系統(tǒng)，設(shè)置相關(guān)實驗參數(shù)和打印參數(shù)。將15%的明膠溶液加入料筒，進(jìn)行3D生物打印。

2.結(jié)果

(1)不同濃度的明膠水凝膠的制備結(jié)果

制備出來的不同濃度的Gel-MA如圖1，經(jīng)過紫外光固化后的Gel-MA形態(tài)固定，呈透明態(tài)，透光性較好。在濃度為10%～20%的范圍內(nèi)，濃度越低，Gel-MA越透明，透光性越好。

圖1

(2)不同濃度的明膠水凝膠的溶脹性能測試結(jié)果

不同濃度的Gel-MA在6小時已基本達(dá)到了溶脹平衡。濃度為10%的Gel-MA的溶脹率最高，20%的Gel-MA的溶脹率最低。在濃度范圍為10%～20%的范圍內(nèi)，濃度越高，Gel-MA的溶脹率越低。

(3)不同濃度的明膠水凝膠的力學(xué)測試結(jié)果

不同濃度的Gel-MA的力學(xué)測試結(jié)果如圖1C。10%、12.5%、15%，17.5%和20%的Gel-MA的楊氏模量分別為222.57±27.02Kpa、322.75±33.78Kpa、575.18±31.47Kpa，734.17±45.14Kpa和979.42±19.84Kpa。在濃度為10%～20%的范圍內(nèi)，Gel-MA濃度越大，楊氏模量越大。

(4)不同濃度的明膠水凝膠的營養(yǎng)液滲透實驗結(jié)果

不同濃度的Gel-MA的營養(yǎng)滲透實驗結(jié)果如圖2A。從圖可以看出，在濃度為10%～20%的Gel-MA中，營養(yǎng)液滲透較快，且Gel-MA的濃度越低，營養(yǎng)液滲透的越快。

圖2

(5)15%濃度的MA改性明膠水凝膠的3D生物打印結(jié)果

濃度為15%的MA改性明膠水凝膠的3D生物打印結(jié)果如圖2B。3D生物打印表明利用明膠水凝膠可以打印出預(yù)先設(shè)計的幾何形狀，且經(jīng)過紫外光交聯(lián)后，能夠形成具有一定機(jī)械強(qiáng)度的水凝膠膠體。

3.討論

3D生物打印技術(shù)作為組織工程學(xué)領(lǐng)域的重要技術(shù)手段之一，目前顯示出很好的應(yīng)用前景。打印墨水是3D生物打印技術(shù)的核心，以一種無支架的方式模擬目標(biāo)組織的自然結(jié)構(gòu)，能夠制造出多種多樣的生物材料。本研究利用不同濃度的Gel-MA，以生物打印墨水的基本參數(shù)，對其進(jìn)行3D生物打印，對不同濃度的Gel-MA的溶脹性能、力學(xué)性能、營養(yǎng)液滲透、3D生物打印進(jìn)行了研究。今后可利用不同濃度的Gel-MA作為墨水或載體，進(jìn)一步研究進(jìn)行負(fù)載活細(xì)胞的3D打印，用來模擬體內(nèi)組織或器官的結(jié)構(gòu)，構(gòu)建仿生人工組織或器官，并研究其生物學(xué)特性。