酶法提取淡水魚內臟魚油的工藝優化

顧盼祺，魏曉倩，趙利，陳麗麗，江勇，白春清，袁美蘭

(江西科技師范大學 生命科學學院，國家淡水魚加工技術研發分中心(南昌)，南昌 330013)

淡水魚是一種營養豐富、蛋白質含量高的水產食物，是我國人民日常生活飲食的主要蛋白質來源之一。目前大多數淡水魚的加工僅局限在利用魚體肌肉，比如魚片、冷凍魚糜、魚丸等的生產，而對魚內臟、魚頭、魚骨、魚皮、魚鱗等下腳料的加工利用較少。據有關統計，我國每年淡水魚副產物產量超過250萬噸，除了一

小部分被加工成飼料外，絕大部分被直接丟棄，這必定會對環境造成一定污染，甚至引發疾病[1]。魚類加工副產物中普遍存在多種生物活性物質，如膠原、糖胺聚糖、多不飽和脂肪酸、磷脂、維生素、酶、活性肽等[2]，因此具有一定的開發利用價值。對這類副產物進行深層次的加工處理，如用于生產魚油、魚露、內臟鮮味醬、魚醬油等輔助食品[3-6]，既可以提高水產品加工的附加值，又可以避免直接丟棄而污染環境。

魚油富含ω-3系多不飽和脂肪酸，其具有較高的營養價值和保健功效[7]，并且魚油還可用于制備具有獨特風味的魚味香精等風味添加劑，滿足人們的飲食需求。因此魚油已成為近年來研究的熱點之一。但深海魚類資源有限，且其魚油提取成本高，所以淡水魚成為魚油提取的新選擇[8]。目前，魚油的提取方法主要有有機溶劑法、蒸煮法、淡堿水解法、酶解法和超臨界流體萃取法等[9-13]。其中，酶解法是魚油提取的主要方法之一，是利用蛋白酶對蛋白質的水解作用，破壞蛋白質和魚油的結合關系，從而釋放出魚油。相對于傳統淡堿水解法而言，酶法水解不但可以增產，還可充分利用酶法水解產生的蛋白酶水解產物，使資源得到充分利用。本研究通過酶解法來制備魚油，運用單因素試驗和正交試驗得出酶法提取魚油的最佳條件，旨在尋找一種從淡水魚內臟中提取魚油的合適方法，期望能更簡便快速并且高效地處理魚內臟，提高其經濟價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

新鮮淡水魚內臟；木瓜蛋白酶(800000 U/g)、堿性蛋白酶(200000 U/g)：北京索萊寶科技有限公司；中性蛋白酶(100000 U/g)：諾維信生物技術有限公司；鹽酸：西隴化工股份有限公司；氫氧化鉀：上海山浦化工有限公司。

1.2 試驗儀器

試驗儀器見表1。

表1 儀器列表Table 1 The list of instruments

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品的前處理

去掉新鮮淡水魚內臟的膽，剩余部分用蒸餾水清洗干凈并瀝干水后，放入高速組織搗碎機內攪拌成糜狀，用保鮮袋封裝冷藏備用。

1.3.2 淡水魚內臟酶解工藝

稱取20 g經處理的淡水魚內臟糜，放入錐形瓶中，加蒸餾水，調節pH，加入一定量蛋白酶粉末。在一定溫度下對其酶解一定時間后，進行滅酶處理，趁熱使用離心機在4500 r/min的速度下離心15 min，吸出上層魚油，稱取所得魚油的質量。

1.3.3 魚油得率的計算

魚油得率(%)=提取魚油的質量(g)/原料的質量(g)×100%。

1.4 酶種類對淡水魚內臟魚油得率的影響

選用3種蛋白酶(木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶)作為試驗用酶，在包裝標示的各自最適溫度和pH條件下進行酶解提取魚油。其他酶解條件為：酶加入量2%，料液比1∶1(原料∶蒸餾水)，酶解時間4 h，然后離心、收集魚油并稱重，計算得率，研究酶種類對魚油得率的影響。

1.5 單因素試驗

1.5.1 pH值對魚油得率的影響

以上述得到的最佳酶作為試驗用酶，在酶加入量2%，溫度50 ℃，料液比1∶1，酶解時間4 h的條件下，研究酶解pH為5，6，7，8，9時對魚油得率的影響。

1.5.2 酶解時間對魚油得率的影響

在酶加入量2%，溫度50 ℃，料液比1∶1以及1.5.1得到的pH值條件下，研究酶解時間為20，40，60，120，180，240，300 min時對魚油得率的影響。

1.5.3 酶解溫度對魚油得率的影響

在酶加入量2%，料液比1∶1以及前面得到的最佳pH值和酶解時間條件下研究酶解溫度為30，40，50，60，70 ℃時對魚油得率的影響。

1.5.4 酶添加量對魚油得率的影響

在前面得到的最佳pH值、酶解溫度和酶解時間以及料液比1∶1的條件下研究蛋白酶添加量在0.30%、0.60%、1.00%、1.50%、2.00%、2.50%、3.00%時對魚油得率的影響。

1.5.5 料液比對魚油得率的影響

在前面得到的最佳pH值、酶解時間、酶解溫度和酶加入量條件下研究料液比為1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶3、1∶4時對魚油得率的影響。

1.6 正交試驗

根據單因素試驗結果，將中性蛋白酶固定為水解酶，選擇pH、酶解溫度、酶解時間、料液比和加酶量為試驗因素，以淡水魚油得率為指標，根據 L16(45)正交表進行正交試驗，優化酶解條件。正交試驗因素與水平設計見表2。

表2 正交試驗因素與水平設計Table 2 The factors and levels of orthogonal experiment

2 結果與討論

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 酶種類對淡水魚內臟魚油得率的影響結果

由圖1可知，用不同蛋白酶酶解淡水魚內臟，其對魚油得率的影響不同。由于不同酶對肽鍵的專一性不同，因此不同蛋白酶展現出的水解能力不同。用木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶在各自的最佳酶活條件下酶解淡水魚內臟的試驗中發現，中性蛋白酶的酶解效果最好，魚油得率最高，達29.23%；堿性蛋白酶的提取率最低，這與王正云等[14]在研究微波輔助酶法提取青魚內臟魚油中，酶種類對魚油得率影響的試驗的結果基本一致。木瓜蛋白酶的提油率比中性蛋白酶的略低，但木瓜蛋白酶的價格較為昂貴，基本上是中性蛋白酶價格的2倍[15]，對應用于工業生產來講花費較高。因此，后續試驗選擇中性蛋白酶。

圖1 蛋白酶種類對魚油得率的影響

2.1.2 pH值對魚油得率的影響結果

由圖2可知，酶解pH在5～6范圍內，魚油產量隨著pH值的升高而增加，表明pH升高可以促進蛋白水解，有利于魚油的釋放。當pH值為6時，魚油得率取得最高值，為30.82%；pH在6～7之間，魚油得率略有下降；pH為7時的魚油得率為29.61%，pH進一步增大，魚油得率則明顯下降。由此可見，不同酶其pH值適宜范圍不同，酶活性也會因此受到不同程度的影響，過酸或過堿均會引起酶活性降低，甚至導致酶不可逆性失活或者影響酶反應的動力學參數[16]。因此，選定酶法水解pH 為6。

圖2 pH值對魚油得率的影響

2.1.3 酶解時間對魚油得率的影響結果

由圖3可知，隨著酶解時間的延長，魚油得率緩慢增長，原因是隨著酶解時間的增長，酶與底物反應充分，從而破壞了脂肪和蛋白質的結構關系。酶解4 h后，魚油得率達到最高點，王倩倩等[17]在羅非魚油的提取中，也證明酶與底物的反應隨著酶解時間的延長，提取出油脂的含量更高，然而，繼續酶解魚油得率開始下降，這可能是因為中性蛋白酶隨著時間的增加與底物接觸較為充分，基本達到平衡的作用狀態[18]。此外，淡水魚下腳料中提取的魚油在空氣中暴露的時間越長，魚油中的不飽和脂肪酸被氧化的越多，這不但會使魚油的品質受到影響，而且會增加能源的消耗[19]。單因素方差分析后發現，酶解時間對魚油得率影響不顯著，即在所試驗的酶解時間內，隨著酶解時間的增加，魚油得率變化不明顯(p>0.05)，但所提取的魚油的色澤由淡黃色轉變為棕褐色，且提取魚油的周期也越長。為了生產工藝經濟效益最大化，故選定酶法水解20 min為宜。

圖3 酶解時間對魚油得率的影響

2.1.4 酶解溫度對魚油得率的影響結果

由圖4可知，魚油得率隨著酶解溫度的升高而逐漸升高，當酶解溫度為30～50 ℃范圍內時，魚油得率升高明顯。當酶解溫度大于50 ℃時，魚油得率上升緩慢，這是由于溫度的升高加快了高分子熱運動，促使酶與底物更加充分地接觸，進而促進酶解，但溫度過高會使魚油的色澤加深，腥味變重，降低魚油的品質。綜合考慮，酶法水解溫度以50 ℃為宜。

圖4 酶解溫度對魚油得率的影響

2.1.5 酶添加量對魚油得率的影響結果

由圖5可知，隨著酶添加量的增加，魚油得率呈先上升隨后略有下降的趨勢。當酶添加量小于1.5%時，魚油得率隨著酶添加量的增加而緩慢提高，當酶加入量大于1.5%時，隨著加酶量繼續增大，得率降低。其原因可能是加酶量不足1.5%時，底物未達到飽和，加酶量達到1.5%時底物已經飽和，繼續增大加酶量對水解促進效果不佳，甚至導致部分酶喪失催化活性。張金哲等[20]研究以鯉魚內臟為原料用酶解法提取油脂的試驗中，發現隨著酶添加量的不斷增加，提油率有先增長再下降的現象，這與本試驗結果相似。在酶添加量為0.3%～1.5%時，魚油得率差異不大(p>0.05)，因此，為了生產工藝經濟效益最大化，最優酶加入量為0.3%。

圖5 酶添加量對魚油得率的影響

2.1.6 料液比對魚油得率的影響結果

由圖6可知，當料液比為1∶1時魚油得率最佳，料液比持續增加，魚油得率反而逐漸下降。可能是淡水魚內臟本身含水量較高，底物濃度相對較合適，增加料液比會增加水分的含量，使底物的濃度被稀釋，影響了酶解速度，酶解效果變差，從而降低了魚油得率。故選擇最適料液比為1∶1。

圖6 料液比對魚油得率的影響

2.2 酶解工藝的優化

依照單因素試驗結果選擇pH、酶解時間、酶解溫度、酶添加量和料液比進行正交試驗，正交試驗結果分析和方差分析見表3。

表3 正交試驗數據及極差分析表Table 3 The orthogonal experimental data and range analysis

由表3極差分析可知，影響中性蛋白酶水解淡水魚內臟提取魚油的各因素主次順序為B>C>A>E>D，即酶解時間>酶解溫度>pH>料液比>酶添加量。采用中性蛋白酶水解淡水魚內臟提取魚油的最佳條件為A4B4C4D3E4，用酶解法提取魚油的最優條件為：pH 7，酶解時間40 min，酶解溫度60 ℃，酶添加量0.50%，料液比(原料∶蒸餾水)1∶1.5。在以上最優的條件下進行魚油提取的驗證試驗得到的魚油得率為35.67%。

3 結論

本文以淡水魚內臟為原材料，以淡水魚魚油得率為指標，通過單因素試驗和正交試驗對酶法提取魚油的工藝條件進行優化，得到了魚油提取的最佳工藝條件為：選擇中性蛋白酶，pH為7，酶解時間為40 min，酶解溫度為60 ℃，酶添加量為0.50%，料液比為1∶1.5。在最佳條件下，魚油得率可達35.67%。本研究結果為淡水魚內臟的開發利用提供了一定的研究基礎。