基于PCR-DGGE技術對糍粑辣椒腐敗過程細菌多樣性動態研究

吳昭慶，胡萍*，程華，楊欣

(1.貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴陽 550025；2.貴州省長順黔南山綠色食品有限公司，貴州 黔南布依族苗族自治州 550700；3.貴州省安順職業技術學院，貴州 安順 561000)

貴州辣椒資源豐富，營養價值高，是一種重要的藥食同源蔬菜[1-2]。糍粑辣椒作為貴州獨具一格的地方特色辣椒制品，選用干紅辣椒、姜、蒜等為原料，經高溫煮制、鐳砵搗碎而得，是貴州特色辣子雞和油辣椒等家常菜肴的特色佐料，具有色澤鮮艷、味道鮮美、風味獨特等特點[3]。

糍粑辣椒水分含量較高，即使在冰箱中冷藏保鮮，其保質期也不超過1周，所以出現了產品難以保存、不易貯藏、保質期短的技術難題。目前對糍粑辣椒的研究鮮有報道[4-5]，對糍粑辣椒中腐敗微生物及致腐機理更是不清楚，為了采取有針對性的措施延長產品的保質期，必須掌握糍粑辣椒的優勢腐敗菌及其生長影響因素。

PCR-DGGE技術可較為全面地體現樣品微生物的多樣性及細菌群落結構的動態變化，該技術也被廣泛應用于食品中微生物菌相的變化分析[6-11]，在由微生物所引起的食品腐敗變質方面提供了較大的技術支撐[12-14]。丁文等[15]采用傳統培養和非培養(PCR-DGGE)比較的方法對熱處理辣椒醬中的殘留微生物情況進行了研究，得出采用傳統培養法不易對某些相對豐度較低的微生物菌株進行分離，采用PCR-DGGE 技術則可更全面準確地反映辣椒醬中微生物種類的多樣性。因此，本研究基于PCR-DGGE技術對糍粑辣椒腐敗過程中細菌群落微生物進行動態變化監控分析，明確其中的優勢腐敗菌群及腐敗特點，為后續如何利用適當的保鮮技術、有效的殺菌方式，有針對性地抑制糍粑辣椒腐敗微生物的生長，為提高貴州糍粑辣椒制品的質量穩定安全性和延長貨架期提供一定的科學理論依據和指導。

1 材料與方法

1.1 材料

樣品：取自貴州省黔南山綠色食品有限公司，新鮮生產未作任何處理的糍粑辣椒樣品(約500 g)，樣品采集完成后，立即送到實驗室進行0～7 d的DNA提取及相關理化指標的測定。

1.2 實驗試劑

溶菌酶、去離子甲酰胺、TE緩沖液(8.0)、Tris-平衡酚：北京索萊寶科技有限公司；溴化乙錠(ethidium bromide, EB)：美國Sigma公司；PCR引物：上海捷瑞生物技術有限公司；GoTaq?Green Master Mix：美國Promega公司；無水乙醇：重慶川東化工有限公司；實驗所用其他有機、無機試劑：均為分析純，市售。

1.3 主要儀器設備

Micro 17R微量高速冷凍離心機 美國 Thermo Electron公司；DK-98-Ⅱ電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司；渦旋振蕩器、混合機 江蘇省海門市麒麟醫用儀器廠；立式壓力蒸汽滅菌器 江陰濱江醫療設備有限公司；Gel Doc XR凝膠成像系統、PCR儀 美國BIO-RAD公司；超純水儀 上海市和泰儀器有限公司；電子天平 上海浦春計量儀器有限公司；快速水分測定儀 深圳冠亞水分儀科技有限公司；便攜式pH計 深圳德圖儀表有限公司。

1.4 方法

1.4.1 細菌總DNA的提取

參照臧凱麗等、樊敏等[16-17]的方法，準確稱取10 g糍粑辣椒樣品放入250 mL三角瓶中，加入磷酸鹽緩沖液(137 mmol/L NaCl, 4.3 mmol/L NaH2PO4·7H2O, 1.4 mmol/L KH2PO4, 2.7 mmol/L KCl) ，用4層無菌紗布過濾粗渣，收集無渣濾液，用移液槍吸取至2 mL離心管中，10000×g離心6 min，倒掉清液，富集沉淀,若沉淀量少，可重復2～3次，然后加400 μL溶菌酶 (質量濃度50 mg/mL)，在37 ℃條件下進行1 h的水浴(每隔20 min搖勻一次)；水浴后加入200 μL的十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)(10%)，在60 ℃條件下進行20 min的水浴；水浴后先加入100 μL 5 mol/L NaCl，再加入600 μL十六烷基三甲基溴化銨 (hexadecyl trimethyl ammonium bromide, CTAB)，在65 ℃條件下進行15 min的水浴，然后將水浴后的混合溶液12000×g離心6 min，用移液槍吸取上清液與等體積的Tris-飽和酚∶氯仿∶異戊醇為25∶24∶1溶液混勻，12000×g離心5 min；吸取上清液至新的離心管，與等體積的氯仿∶異戊醇為24∶1溶液混勻，12000×g離心5 min；吸取上清液至新的離心管，加入2倍體積分數為30%聚乙二醇和3 mol/L 1/8體積NaCl，于4 ℃條件下放置3 h后取出于12000×g離心10 min，倒掉上清液，吸取200 μL冰乙醇洗滌，加60 μL TE緩沖液置于-20 ℃條件下保存備用。

1.4.2 感官評定標準

參照《貴州糍粑辣椒制作工藝》稍作修改。

1.4.3 菌落總數的測定

參照《微生物學試驗教程》[18]。

1.4.4 Aw值的測定

參照GB 5009.3-2010《食品中水分的測定》。

1.4.5 pH值的測定

參照GB/T 10468-1989《水果和蔬菜產品pH值的測定方法》[19]。

1.4.6 總酸含量的測定

參照GB/T 12456-2008《食品中總酸的測定》[20]。

1.4.7 PCR擴增

1.4.7.1 第1輪PCR擴增(巢式PCR)

采用27F[21](AGA GTT TGA TCC CTC AG)和1492R(GGT TAC CTT GTT ACG ACT T)通用引物對細菌進行16S rDNA全長擴增。反應總體系(25 μL)：DNA模板2 μL，引物(1 μmol/L)各2 μL，Go Taq?Green Master Mix(2X)12 μL，滅菌dd H2O 6 μL。PCR擴增程序：95 ℃預變性2 min；94 ℃變性1 min，58.5 ℃退火1 min；72 ℃延伸2 min,共25個循環；最終72 ℃延伸2 min。

1.4.7.2 第2 輪PCR擴增(降式PCR)

以2 μL第1輪PCR產物為模板DNA，采用引物GC-338F(GC-ACT CCT ACG GGA GGC AGC AG)和518R(ATT ACC GCG GCT GCT GG)擴增，反應總體系25 μL(同上)。PCR擴增程序：94 ℃預變性4 min，94 ℃變性1 min，退火溫度從67.5 ℃降至57.5 ℃，每個循環降低0.5 ℃，退火時間是3 s，72 ℃延伸1 min，20個循環；恒定退火溫度下進行94 ℃變性1 min， 57.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min,共10個循環。

1.4.7.3 第3輪PCR 擴增(Reconditioning PCR)

以2 μL第2輪PCR產物為模板DNA，采用引物338F(ACT CCT ACG GGA GGC AGC AG)和518R(ATT ACC GCG GCT GCT GG)進行Reconditioning PCR擴增。反應總體系25 μL(同上)，PCR擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，57 ℃退火35 s，72 ℃延伸1 min，為5個循環；最終72 ℃延伸5 min。

PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.4.8 變性梯度凝膠電泳(DGGE)

對樣品細菌16S rDNA V3區擴增產物進行DGGE電泳。參照胡萍[22]的條件稍作改動：8%聚丙烯酰胺凝膠，變性梯度范圍35%～65%(其中100%變性劑含有7 mol/L尿素和40%甲酰胺)；上樣后在0.5×TAE緩沖液(TAE緩沖液是由三羥甲基氨基甲烷、乙酸和乙二胺四乙酸組成)中200 V預電泳10 min，然后85 V電泳16 h，EB染色后置于凝膠成像儀，在系統內拍照，采用Quantity One (Bio-Rad)分析軟件進行圖像分析。

1.4.9 條帶回收及測序

在無菌操作下，用無菌刀片將DGGE膠上不同位置的條帶切下，放入2 mL離心管中，搗碎后加入20 μL ddH2O，于4 ℃過夜。吸取2 μL為模板DNA對16S rDNA V3可變區域進行擴增(條件同1.4.7.2)。將PCR產物經過DGGE證明和所割條帶在相同遷移位置后再割膠回收,使用引物(不含GC夾子)對16S rDNA V3的可變區再次進行擴增，將純化后的PCR產物送到上海紅生物工程技術公司進行測序。登錄NCBI(nationalc enter of biotechnology information)中的GenBank數據庫進行序列相似性比對。

1.4.10 數據處理

采用 Excel 2017對所得數據進行計算，Mega 7.0構建系統發育樹，所有數據測定均重復3次，結果采用平均值±標準差來表示。

2 結果與分析

2.1 糍粑辣椒貯藏過程中的感官及理化品質

對0～7 d糍粑辣椒每隔24 h記錄其感官品質，結果見表1。

表1 糍粑辣椒貯藏過程中的感官品質Table 1 The sensory quality of Ciba pepper during storage

由表1和表2可知，糍粑辣椒貯藏0～7 d過程中，感官品質隨著貯藏時間的延長而逐漸下降，從第0天的色澤鮮艷呈亮棕紅色，組織狀態粘稠度好，呈泥狀，氣味濃郁，香味突出，愉悅有食欲，到第6天的色澤呈暗紅色，組織狀態粘稠度很差，質地稀薄，有略微酸腐異味這些腐敗特征；水分活度值是決定食品腐敗變質和保質期的重要參數，水分活度越小的食物越穩定，較少出現腐敗變質現象，糍粑辣椒Aw值從第0天的(61.75±0.15)%到第6天的(59.61±0.12)%，呈下降趨勢，但是糍粑辣椒總體Aw還是過高，說明Aw值給微生物提供了一個良好的生長環境，是導致糍粑辣椒腐敗變質的一個重要因素；pH和菌落總數值是反映食品品質的重要指標，能夠反映食品在貯藏過程中的微生物代謝和生長繁殖情況，總酸含量可以反映糍粑辣椒中酸味物質含量變化，會使糍粑辣椒產生酸腐味，從而可判定為已腐敗變質，糍粑辣椒pH值從第0天的5.21±0.02降到第6天的4.67±0.04，總酸值也從第0天的(4.17±0.05) g/kg升高至第6天的(6.29±0.07) g/kg；菌落總數值從第0天的(3.25±0.05) lg CFU/g增加到第6天的(7.12±0.03) lg CFU/g，說明隨著貯藏天數的增加，微生物大量生長繁殖，在酶和產酸菌的共同作用下產酸，從而導致pH值逐漸降低，總酸含量逐漸升高，產品品質急速下降，最終導致產品發生腐敗變質。綜上所述，通過對感官的評定和理化指標的測定得出本研究糍粑辣椒在第6天已達到肉眼可見的顯著腐敗。

表2 糍粑辣椒理化指標的測定Table 2 The detection of physical and chemical indexes of Ciba pepper

2.2 細菌PCR擴增結果

圖1 PCR電泳結果

2.3 DGGE細菌圖譜微生物多樣性分析

糍粑辣椒樣品0～7 d細菌總DNA的DGGE圖譜見圖2。

圖2 樣品貯藏過程細菌總DNA的DGGE圖譜

采用2次重復檢測驗證每個取樣點條帶的方式，結果顯示DGGE圖譜皆無明顯差異。DGGE圖譜上條帶的多少和亮度分別代表微生物種類的多少和數量的多少[23]，條帶越多說明樣品的菌種種類越豐富，條帶越粗亮說明該種微生物數量多，占優勢。圖譜上不同遷移位置條帶代表著不同種類的微生物，相同的遷移位置代表著相同的條帶，同種微生物遷移位置相同，即為相同條帶，反之，則稱為差異性條帶[24]。由DGGE圖可以看出，在0～7 d糍粑辣椒貯藏動態監測過程中，檢測出較多條帶，也都比較亮，表明糍粑辣椒中微生物多樣性較高，優勢菌較突出。將DGGE圖譜上不同的條帶進行割膠、DNA回收、測序，登錄NCBI網站在Blast軟件中的GenBank數據庫里進行序列比對，其分析結果見表3，條帶8，12分別為潘氏泛酸菌株(Pantoeacypripedii)、非培養的羅思河小桿菌屬(UnculturedRhodanobactersp.)，相似性為93%、92%，其余條帶檢測出的細菌相似性則均達95%以上，其中，條帶10，14分別為蔥屬洋蔥菌(Alliumcepa)、阿里谷氨酸桿菌(Glutamicibacterarilaitensis)，其相似性高達100%。

表3 DGGE條帶細菌16S rDNA部分基因序列比對分析Table 3 The sequence analysis of bacterial 16S rDNA partial genes of DGGE bands

由圖2和表3可知，糍粑辣椒在0～7 d的貯藏過程中,微生物多樣性較高，有明顯的差異動態演替性。共檢測出14種不同種屬的細菌:Leuconostoclactis，Klebsiellaoxytoca，Weissellasp.,Serratiasp.,Leclerciaadecarboxylata, UnculturedChroococcidiopsissp.,Pantoeacypripedii,Alliummonanthum,Arthrobactersp.,Paenarthrobacternitroguajacolicus,Glutamicibacterarilaitensis, UnculturedRhodanobactersp.,Alliumcepa和Alliumxichuanense。貯藏1 d時，糍粑辣椒微生物菌相較0 d時發生了明顯的變化，條帶顯著增多，變亮，條帶4，5，9，11，12顯現且較亮，分別屬于沙雷氏菌(Serratiasp.)、阿德萊斯特菌(Leclerciaadecarboxylata)、節桿菌(Paenarthrobacternitroguajacolicus)、西川蔥屬(Alliumxichuanense)、非培養的羅思河小桿菌(UnculturedRhodanobactersp.)。貯藏2 d時，菌相又有不同變化，條帶4，5，11，12消失，條帶2，6，8，9明顯變亮，分別屬于產酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytocastrain)、蔥屬菌(Alliummonanthum)、潘氏泛酸菌株(Pantoeacypripedii)、節桿菌(Paenarthrobacternitroguajacolicus)，直到貯藏第6天時，條帶8，9完全消失，原因可能是樣品貯藏時間過長，所在環境的不利影響和樣品本身水分含量高，pH偏低，總酸升高，細菌大量增長繁殖，產生一系列的代謝產物，從而抑制了條帶8，9的生長[25]。樣品的貯藏過程就是樣品的腐敗過程，條帶8，9是在樣品貯藏過程中逐步出現最后在腐敗終點時才消失的，這與Gram等[26]關于特定腐敗菌(SSO)的理論相符：特定腐敗菌在產品貯藏初期數量很少，僅占微生物群落的很少部分，但在產品腐敗過程中逐漸占據主導地位。從DGGE圖中可以看出，隨著貯藏時間的延長，主要優勢條帶 6，7，10，13，14從樣品初期0 d到整個腐敗后期都一直存在，并且一直處于高濃度亮度，分別屬于蔥屬菌(Alliummonanthum)、未培養的球菌(UnculturedChroococcidiopsissp.)、蔥屬洋蔥菌(Alliumcepa)、關節桿菌(Arthrobactersp.)、阿里谷氨酸桿菌(Glutamicibacterarilaitensis)，不僅粗而且亮，在腐敗過程中占據著絕對的優勢主導地位，說明它也是糍粑辣椒的主要腐敗菌，且還是糍粑辣椒貯藏過程中的優勢腐敗菌。因此，綜上分析，可以確定糍粑辣椒的主要腐敗菌群為蔥屬菌(Alliummonanthum)、未培養的球菌(UnculturedChroococcidiopsissp.)、蔥屬洋蔥菌(Alliumcepa)、關節桿菌(Arthrobactersp.)、阿里谷氨酸桿菌(Glutamicibacterarilaitensis)，而潘氏泛酸菌株(Pantoeacypripedii)、節桿菌(Paenarthrobacternitroguajacolicus)為糍粑辣椒貯藏過程中的優勢腐敗菌。

將細菌DGGE圖譜上切割條帶測序結果進行系統發育樹的構建，結果見圖3。

圖3 菌株系統發育樹

所得測序結果可以分為3個類別：類別Ⅰ為未培養的球菌(UnculturedChroococcidiopsissp.)、節桿菌(Paenarthrobacternitroguajacolicus)、蔥屬洋蔥菌(Alliumcepa)、非培養的羅思河小桿菌(UnculturedRhodanobactersp.)、阿德萊斯特菌(Leclerciaadecarboxylata)、西川蔥屬(Alliumxichuanense)、蔥屬菌(Alliummonanthum)、潘氏泛酸菌株(Pantoeacypripedii)、阿里谷氨酸桿菌(Glutamicibacterarilaitensis)，包含條帶為7，9，10，12，5，11，6，8，14，類別Ⅱ為關節桿菌(Arthrobactersp.)，包含條帶是13，類別Ⅲ是乳明串珠菌(Leuconostoclactis)、產酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytocastrain)、魏斯氏菌(Weissellasp.)、沙雷氏菌(Serratiasp.)，包含條帶為1，3，2，4。

3 結論

本研究基于PCR-DGGE技術對糍粑辣椒腐敗過程中的細菌多樣性進行動態分析，研究結果表明：樣品貯藏0～7 d過程中，隨著貯藏時間的延長，pH和Aw值呈下降趨勢，菌落總數和總酸值則顯著升高，感官評定呈逐漸降低趨勢，綜合分析得出在第6天達到肉眼可見的腐敗終點。通過DGGE共檢測出14種不同種屬的細菌，從而確定糍粑辣椒腐敗過程中的主要腐敗菌群是蔥屬菌(Alliummonanthum)、未培養的球菌(UnculturedChroococcidiopsissp.)、蔥屬洋蔥菌(Alliumcepa)、關節桿菌(Arthrobactersp.)、阿里谷氨酸桿菌(Glutamicibacterarilaitensis)，其中，優勢腐敗菌則是潘氏泛酸菌株(Pantoeacypripedii)、節桿菌(Paenarthrobacternitroguajacolicus)。本研究結果將為糍粑辣椒貯藏過程中微生物的腐敗研究提供非常重要的生物學數據支撐，同時也為如何延長糍粑辣椒保質期技術的研究及采用針對性的抑制手段提供了強大的理論支撐。