傳統自然發酵蔬菜的顯微表征及其細菌群落多樣性分析

金華，呂嘉櫪，羅瀟

(陜西科技大學 食品與生物工程學院，西安 710021)

傳統發酵蔬菜通過原料中攜帶的微生物進行發酵[1-2]。目前國內自然發酵蔬菜代表性的產品有四川涪陵榨菜、四川泡菜、東北酸菜、貴州辣椒醬以及以甘肅蘭州和陜西陜南為代表的漿水菜等[3-8]。傳統自然發酵蔬菜中包括乳酸菌、酵母菌、芽孢桿菌以及少量的其他菌群[9-12]。目前的研究報道發酵過程中發揮作用的主要是乳酸菌，發酵后期蔬菜產生乳酸、乙酸等擁有獨特風味的物質[13-15]。

目前對發酵蔬菜的研究主要集中在自然發酵過程中各個階段微生物菌群結構、優勢菌群以及產品的感官品質等方面[16-18]，通過顯微表征對傳統發酵蔬菜的研究主要集中在單個樣品或樣品中分離出來的單個菌株等方面[19-20]，其樣本量少，不能全面反映傳統發酵蔬菜的微生物群落結構，而且結合泡菜與漿水菜兩者相互對照的研究未見報道。對傳統發酵蔬菜中微生物的菌群多樣性研究，多是選用分離、純化、鑒定這些傳統的方法，然而環境中能夠用來培養的微生物只能占到微生物總數的0.1%～10%[21]，傳統的分離純化培養方法不能真實全面地反映傳統發酵蔬菜中微生物的菌群多樣性。魏本良等[22]通過高通量測序分析陜西地區漿水中細菌多樣性。張安等[23]采用構建16S rRNA基因文庫的方法對四川泡菜的微生物多樣性進行了分析，但對陜西地區的傳統發酵蔬菜中微生物的多樣性缺乏全面分析。

因此，本研究為揭示不同的陜西地區市售發酵蔬菜制品中菌群群落結構的差異性，以具有代表性的19種陜西省西安市市售傳統發酵蔬菜為試驗樣品，采用掃描電子顯微鏡與Illumina MiSeq高通量測序技術相結合，對樣品的細菌群落結構多樣性進行研究，研究結果能夠應用到發酵蔬菜新產品的研制，并且為產品的質量控制與品質提高提供了依據。

1 試驗材料與方法

1.1 供試樣品

在陜西西安的不同地區采集了19種市售傳統發酵蔬菜制品為供試樣品，其中15個樣品為泡菜(HBZ1、HBZ2、HBZ3、XYL1、LHL1、LHL2、LHL3、LHL4、LHL5、SXC1、SXC2、SXC3、SXC4、LHL6、YTQ2)，4個樣品為漿水菜(YTQ1、YTQ3、GLQ1、GLQ2)。

1.2 主要儀器與試劑

主要儀器與試劑見表1。

表1 主要儀器與試劑Table 1 The main instruments and reagent

1.3 試驗方法

1.3.1 傳統自然發酵蔬菜樣品的顯微表征分析

選取19份發酵蔬菜樣品，通過掃描電鏡觀察其發酵液中細菌的群落結構和附著在菜體上細菌的形態數量。

1.3.1.1 發酵液的顯微表征分析

顯微表征采用掃描電子顯微鏡觀察，方法如下[24]：

首先，對發酵蔬菜樣品進行前處理：將發酵液用離心機離心10 min，離心機轉速調至6000 r/min，只取沉淀物，然后繼續倒入發酵液離心(條件與上述相同)，經過數次離心使得離心管底剩余更多的細菌沉淀物。

續 表

隨后進行固定：將上一步操作的管底沉淀用已經配制好的戊二醛溶液(2.5%)固定至少2 h，固定操作后再繼續離心10 min(6000 r/min)，只取沉淀物。

然后清洗：用現配的磷酸緩沖液(pH 7.2，0.1 mol/L)間隔20 min洗滌3次。每次洗滌完成后對其離心(離心條件同上)，只保留管內沉淀物。

后續對其脫水：選取的方法為乙醇梯度脫水，對離心物按照濃度由小到大(30%、70%、100%)進行脫水，將其在每種濃度中間隔20 min脫水3次，每次脫水操作后都要進行離心，離心條件不變。

干燥：將管內沉淀物置于干燥箱，50 ℃烘干。

噴金：通過真空鍍膜設備對干燥后的樣品鍍金以便于后續在掃描電鏡下觀察。

最后進行觀察分析：將經過一系列處理后的樣品置于掃描電鏡下觀察。

1.3.1.2 發酵菜體的顯微表征分析

發酵蔬菜樣品前處理：使用消毒鉗取少量待測樣品。后續步驟同上述發酵液的顯微表征分析步驟。

1.3.2 傳統自然發酵蔬菜樣品的細菌群落結構多樣性分析

上述對19個樣品進行顯微表征的觀察分析，得出觀察分析結果，從中選5個細菌群落多樣的發酵蔬菜制品，并對其進行群落多樣性分析。對5個樣品的總基因組進行提取，并針對16S rRNA V3+V4 區基因片段進行PCR擴增，通過Illumina MiSeq高通量測序分析研究各個樣品中細菌的群落結構。

2 結果與分析

2.1 19種傳統自然發酵蔬菜的顯微表征

2.1.1 發酵液的顯微表征

對19個發酵蔬菜的發酵液進行顯微表征觀察，蔬菜中的營養成分與其中的微生物菌群相互作用，從而使得發酵蔬菜產生各種功能性成分并且還會產生各種風味物質。各樣品發酵液中的菌體形態見圖1。

圖1 19個傳統發酵蔬菜發酵液中菌群的顯微表征

19個傳統自然發酵蔬菜樣品中有15個泡菜樣品和4個漿水菜樣品，泡菜樣品中樣本號HBZ1發酵液中的優勢菌群為球菌，根據形態初步判斷是雙球菌，而發酵液中也存在少量形態不同的桿菌，總體而言，菌群不復雜。樣本號HBZ2、HBZ3發酵液中優勢菌群為桿菌，其中樣本號HBZ2發酵液中優勢菌群為桿菌，而樣本號HBZ3發酵液中菌群相對復雜，有桿菌且有球菌，但桿菌所占比例要高于球菌。樣本號XYL1、YTQ2發酵液中不僅有桿菌還觀察到了酵母菌，因此菌群相對較復雜。樣本號LHL1、LHL2發酵液中比較前幾個樣品更為復雜，菌群包括了球菌、桿菌以及酵母菌，球菌在數量上要多于桿菌和酵母菌。樣本號 LHL3、SXC4發酵液中包括球菌和酵母菌，球菌多于酵母菌，根據查閱相關圖片資料以及對這兩個樣品中酵母菌的形態描述進行分析，其與釀酒酵母的形態比較符合，其中樣本號SXC4發酵液中只觀察到了球菌，由菌體形態判斷其為雙球菌。樣本號LHL4發酵液中菌群以球菌為主，由菌體形態判斷其為四聯球菌。樣本號SXC1發酵液中優勢菌群為球菌，除了球菌還觀察到了數量較多的酵母菌，樣本號SXC2發酵液中包括球菌、桿菌和酵母菌，球菌所占比例大于桿菌和酵母菌。樣本號SXC3發酵液中優勢菌群為球菌，但是菌群較為復雜，通過觀察形態，發現其中包括單球菌、雙球菌以及四聯球菌，還觀察到數量較少的桿菌。樣本號LHL5、LHL6發酵液中優勢菌群為酵母菌，其中球菌所占比例相對較高。漿水菜樣品中樣本號YTQ1、YTQ3發酵液中優勢菌群為桿菌，樣本號GLQ1、GLQ2發酵液中優勢菌群則為酵母菌。19個傳統自然發酵蔬菜樣品中漿水菜發酵液中的菌群較泡菜樣品復雜。主要以球菌和桿菌數量居多，但大多數樣品發酵液中都存在酵母菌。總的來說，不同樣品中的菌體種類、形態各不相同。

2.1.2 菜體表面顯微表征

環境中的一些微生物具有一定的粘附力，而發酵蔬菜的菌群包括發酵液中存在的和附著在菜體表面的菌群。顯微表征19個樣品菌群在菜體表面的存在情況見圖2。

圖2 19個市售傳統發酵蔬菜在菜體表面的顯微表征

由圖2可知，發酵蔬菜樣品中的泡菜樣品樣本號HBZ1、LHL3、LHL4的菜體上能明顯看到附著一些球菌。其中觀察樣本號HBZ1菜體上的球菌鑲嵌在菜體表面，通過形態分析其應為單球菌。而樣本號LHL3在菜體表面上可看到許多球菌，通過形態學分析其包括單球菌和雙球菌，其中在樣本號LHL4的菜體表面觀察到許多堆積在一起的球菌，通過形態學分析其應為四聯球菌。樣本號SXC3、YTQ2菜體表面看到一些桿菌，樣本號SXC4菜體表面能夠觀察到球菌，包括單球菌與四聯球菌。樣本號LHL6菜體表面則附著了大量的酵母菌，剩余的樣品(樣本號XYL1、HBZ2、HBZ3、SXC1、SXC2、LHL1、LHL2、LHL5)菜體表面很少觀察到附著的菌體。而漿水菜樣品中樣本號GLQ1、GLQ2菜體表面也可以觀察到附著的一些酵母菌，樣本號YTQ1、YTQ3菜體表面則很少能看到附著的菌體。總體而言，19個傳統自然發酵蔬菜樣品中發酵液中的菌群相對較菜體表面的豐富，而漿水菜中的菌群較泡菜中的菌群豐富，通過查閱相關文獻，傳統發酵蔬菜中存在一些球菌和酵母菌具有一定的粘附力，因此可以附著在菜體表面[25]。

2.2 細菌群落多樣性

以上述19個樣品進行顯微表征的觀察分析結果中選擇5個細菌群落多樣的發酵蔬菜制品，分別為樣本號HBZ1、HBZ2、LHL2、LHL5、LHL6，通過Illumina MiSeq高通量測序分析研究各個樣品中細菌的群落結構。

2.2.1 PCR擴增產物

分別提取5個細菌群落多樣的發酵蔬菜制品的總基因組，然后利用PCR擴增其16 S rRNA V3+V4 區基因片段，其中瓊脂糖凝膠電泳檢測結果見圖3。

圖3 5個傳統發酵蔬菜樣品細菌基因組PCR產物電泳圖

由圖3可知，PCR擴增的目的是為了保證合適的濃度，使得后續的試驗結果準確。在250～500 bp之間所對應的位置可以看到5個發酵蔬菜制品都有明顯的條帶，說明PCR產物目的條帶大小正確，濃度合適，可以繼續試驗。

2.2.2 細菌群落α-群落結構多樣性分析

5個菌群豐富的樣品細菌α-群落結構多樣性分析見表2。

表2 5個傳統發酵蔬菜樣品中細菌群落結構多樣性指數Table 2 The diversity indexes of bacterial community structure of 5 traditional fermented vegetable samples

由表2可知，所選擇測試的5個菌群豐富的樣品，其中樣本號HBZ2菌群豐度指數在所有測試的5個樣品中最高，菌群豐度指數由高到低依次為樣本號HBZ2、HBZ1、LHL2、LHL6和LHL5。為反映每個樣品中細菌群落的真實情況，本次測序深度均不低于0.997。測試結果反映出細菌群落豐富，多項指數對比表現出明顯的差異。

圖4 5個傳統發酵蔬菜樣品在屬的水平上的細菌組成

5個傳統發酵蔬菜樣品在屬水平上的細菌組成有65個屬，此外，還存在4株無法培養的菌株。在這65個屬中主要為乳桿菌屬(Lactobacillus)和片球菌屬(Pediococcus)菌群豐度指數比較高。乳桿菌屬在樣本號HBZ1中的豐度為35.70%，在樣本號HBZ2中的豐度為83.36%，在樣本號LHL2中的豐度為89.24%，在樣本號LHL5中的豐度為95.03%，在樣本號LHL6中的豐度為94.83%，片球菌屬在樣本號HBZ1中的豐度遠遠高于其余4個樣品，豐度為59.59%，其余樣品的豐度：樣本號HBZ2中的豐度為1.60%，樣本號LHL2中的豐度為2.19%，樣本號LHL6中的豐度為2.94%，其中樣本號LHL5中的豐度最低，為1.04%。此外，還在樣本號HBZ2中檢測出了豐度相對較高的假單胞菌屬(Pseudomonas，豐度為2.04%)、擬桿菌屬(Bacteroides，豐度為1.54%)和泛生菌屬(Pantoea，豐度為1.44%)。在樣本號LHL5中檢測出豐度相對較高的海細菌屬(Marinobacterium)，豐度為2.67%。在樣本號LHL6中檢測出豐度相對較高的水螺菌屬(Aquaspirillum)，豐度為1.05%。此外，還檢測到豐度較低的弓形菌屬、硫桿菌屬、食堿菌屬、棒狀桿菌屬、類芽孢桿菌屬、雙歧桿菌屬、希瓦氏菌屬、硝化螺旋菌屬、鹽單胞菌屬、魏斯氏菌屬、羅氏菌屬等。

由圖5可知，5個樣品細菌各屬的豐度存在明顯差異，圖中右側是屬名，表示不同的屬，隨著豐度指數不斷增加，其顏色由藍色逐漸過渡到紅色，顏色不同表示豐度不同。不同屬在不同的樣品中所占的比例各不相同。其中乳桿菌屬在5個樣品中所占的比例都較高，而樣本HBZ1中片球菌屬的顏色要略深于乳桿菌屬，在其余4個樣本中乳桿菌屬的顏色最深，為優勢菌屬。而且通過顏色塊分析乳桿菌屬在樣本LHL5中占絕對優勢。

圖5 5個傳統發酵蔬菜樣品細菌核心屬及其分類水平熱圖Fig.5 The heat map of bacterial core genera and their classification level in 5 traditional fermented vegetable samples

由圖6可知，在屬水平，樣本的聚類樹由兩個分枝組成，其中一枝由樣本HBZ1與LHL6組成，而另一枝由樣本HBZ2、LHL2、LHL5組成，處于同一枝的樣本，說明其菌群構成在屬分類水平上相似，所以樣本HBZ1和LHL6的菌群構成相似，而樣本HBZ2、LHL2、LHL5的菌群構成相似。

圖6 屬水平下樣本聚類樹與柱狀圖組合分析圖

圖7 5個傳統發酵蔬菜樣品在種的水平上的細菌組成Fig.7 The bacterial composition of 5 traditional fermented vegetable samples at the species level

樣本在種水平上的細菌組成分為40個種，整體而言，5個樣本中除了樣本HBZ1的優勢菌不同于其他4個樣本，其余樣本的優勢菌比較統一。不可培養的乳桿菌(unculturedLactobacillussp.)在樣本HBZ2、LHL2、LHL5中的豐度要遠遠高于樣本HBZ1、LHL6中的豐度，在樣本HBZ1中菌群豐度指數為3.57%，在樣本HBZ2中菌群豐度指數為50.74%，在樣本LHL2中菌群豐度指數為40.69%，在樣本LHL5中菌群豐度指數為52.66%，在樣本LHL6中菌群豐度指數為9.72%。片球菌屬未知種(Pediococcusethanolidurans)在樣本HBZ1中的豐度要明顯高于其余樣本，在樣本HBZ1中菌群豐度指數為59.59%，在樣本HBZ2中菌群豐度指數為1.60%，在樣本LHL2中菌群豐度指數為2.19%，在樣本LHL5中菌群豐度指數為1.04%，在樣本LHL6中菌群豐度指數為2.94%。一株未鑒定菌(unidentified)在5個樣本中豐度所占比例都較高，在樣本HBZ1中菌群豐度指數為30.01%，在樣本HBZ2中菌群豐度指數為37.03%，在樣本LHL2中菌群豐度指數為49.00%，在樣本LHL5中菌群豐度指數為42.85%，在樣本LHL6中菌群豐度指數為84.64%。除此之外，檢測到的一些希瓦氏菌、紅串紅球菌、奧斯陸莫拉菌、糞產堿菌、Aeromonascaviae、芽孢桿菌、短黃桿菌、短乳桿菌等豐度比較低的菌種。

2.2.3 核心OTU在NCBI數據庫中的比對結果

5個傳統自然發酵蔬菜樣品一共分出了113個OTU，選擇其中豐度較高的4個OTU ，根據其在5個樣本中的豐度占比與NCBI數據庫中進行Nucleotide blast 比對及相似性搜索，比對結果見表3。

表3 OTU1～OTU4 16S V3+V4區序列比對結果Table 3 OTU1～OTU4 16S V3+V4 sequence alignment results

由表3可知，最后的比對結果顯示4個OUT分別為耐酸乳桿菌、乙醇片球菌、布氏乳桿菌和植物乳桿菌，其中耐酸乳桿菌、乙醇片球菌和植物乳桿菌具有100%的相似性，而布氏乳桿菌的相似性也達到了99%。結果與顯微表征的分析相符合，鑒定出豐度較高的4個優勢菌種，其中只有植物乳桿菌在發酵蔬菜中比較常見，而這種耐酸桿菌通常出現在酸度較高的發酵后期。

3 結論

通過對19個傳統自然發酵蔬菜樣品的顯微表征和細菌群落結構的多樣性進行分析研究，結果表明：19個樣本的顯微表征形態各異，具有顯著差異，菌群結構各不相同，泡菜樣品中菌群結構相對單一，而漿水菜樣品中菌群結構比較復雜。發酵液中細菌菌群的種類和數量都較菜體上豐富。利用高通量測序技術對其中5個菌群豐富的發酵蔬菜樣本進行測序，每個樣本中細菌的屬所占的豐度各不相同，乳桿菌屬的豐度值在除樣本HBZ1之外的4個樣本中遠遠大于豐度值低的菌屬，而在樣本HBZ1中主要為乳桿菌屬和片球菌屬，其中片球菌屬為優勢菌屬。與數據庫比對鑒定出的4個優勢菌中只有植物乳桿菌常見于研究資料中，而且4個優勢菌種在5個樣本中的豐度要遠高于豐度低的菌種。