低色素黃原膠發酵條件優化

劉詠梅　丁悅　張柯

關鍵詞：黃原膠;野油菜黃單胞菌;蔗糖;低色素

黃原膠（xanthan gum）是以碳水化合物為生產原料，由黃單胞菌發酵形成的一種生物高分子多糖[1]。黃原膠常被制成懸浮劑、乳化劑、增稠劑、穩定劑，擁有良好的市場前景，在醫藥、食品工業、石油開采等行業得到了廣泛的應用[2-3]。

黃原膠無味、無毒，是安全的固體粉末，不溶于乙醇或者丙酮，有較好的水溶性，溶解于水中呈現為透明狀的膠體[4]。黃原膠分子的結構D-甘露糖上有乙酸和丙酮酸結構，三糖側鏈連在每一個葡萄糖上，因為結構特殊，所以擁有諸多良好的性質，如高黏性，對酸、堿、酶的穩定性以及耐高溫穩定性[5-6]。

本實驗通過連續培養的方式獲得一株細胞壁缺陷型野油菜黃單胞菌突變株。黃原膠發酵常受到色素含量高、純化成本高的制約[7-9]。該菌具有發酵產黃原膠過程中色素含量低的優點，本研究采用該菌株為出發菌株，考察最優發酵條件。

1 實驗材料

1.1 菌種

野油菜黃單胞菌（xanthomonas campestris）1.1781購于中國普通微生物保藏管理中心。野油菜黃單胞菌（xanthomonas campestris）1.1781細胞壁缺陷型突變株，由本研究室馴化并保存。

1.2 試劑

蔗糖、碳酸鈣（國產分析純試劑），蛋白胨，高核酸酵母，牛肉浸膏，瓊脂。

1.3 培養基

斜面培養基：牛肉浸膏2.0 g/L，酵母粉5.0 g/L，蔗糖10.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，瓊脂20.0 g/L，pH為7.0。

發酵培養基：蔗糖70.0 g/L，碳酸鈣0.5 g/L，高核酸酵母1.0 g/L，K₂HPO₄·3H₂O 0.5 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5 g/L，pH為7.0。

1.4 儀器與設備

烘箱、電子天平（RP5002K）、凈化工作臺（SW-CJ-1D）、離心機（H1850）、搖瓶柜（HYL-A）、手提式壓力蒸汽滅菌器（YXQ-SG46-2805A）、生化培養箱（SPX-100B-Z）。

2 實驗方法

2.1 培養方法

將菌種接入斜面培養基，28 ℃培養24 h備用。在無菌條件下，取一環菌體，接入發酵培養基中，在30 ℃、200 r/min條件下培養72 h。

2.2 菌體濕重

取20 mL發酵液，添加無菌水至50 mL，搖勻后離心（6 000 r/min，10 min）。棄上清液，收集菌體，將離心管在紙巾上倒置10 min，稱取濕重。

2.3 發酵條件優化

2.3.1 不同碳源

黃原膠的產量和質量與碳源的種類﹑加入量有直接的關系[8-9]。考察不同碳源在黃原膠發酵過程中對產膠量的影響，采用（NH₄）₂HPO₄作為氮源，在發酵培養基中分別加入蔗糖、果糖、葡萄糖、甘油、甘露醇作為碳源，裝液量50 mL，在30 ℃、200 r/min條件下培養72 h后測定產量。

2.3.2 不同氮源

采用蔗糖為碳源，分別考察不同氮源[牛肉浸膏、酵母粉、（NH₄）₂HPO₄、蛋白胨、高核酸酵母]對黃原膠發酵的影響。培養條件同2.3.1。

2.3.3 初始pH

配制20 mmol/L的Na₂HPO₄·12H₂O和NaH₂PO₄·2H₂O緩沖溶液，分別配制pH為6.6、6.8、7.0、7.2、7.4的緩沖液直接用于發酵培養基配制。考察采用20 mmol/L不同pH磷酸緩沖液配制培養基對黃原膠產量的影響。

3 結果與討論

3.1 菌體生長曲線

在30 ℃、200 r/min條件下測定菌體生長曲線。每10 h取樣一次，觀察測定菌體質量濃度，收集數據并繪制菌體生長曲線（見圖1）。由圖1可知，30 h之前生長迅速，之后菌體生長變慢，進入穩定期。后續采用培養時間為20 h左右、處于對數生長期的菌體進行發酵產膠實驗。

3.2 碳源對黃原膠產量的影響

野油菜黃單胞菌（xanthomonas campestris）1.1781細胞壁缺陷型突變株可利用多種碳源發酵產黃原膠。該菌對低分子質量糖類碳源的利用效果較好、產量較高，轉化率較高的是蔗糖與葡萄糖（見表1）。

3.3 氮源對黃原膠產量的影響

采用蔗糖為碳源，分別考察不同氮源[牛肉浸膏、酵母粉、（NH₄）₂HPO₄、蛋白胨、高核酸酵母]對黃原膠發酵的影響。黃原膠發酵分為兩個階段，第一階段為菌體生長階段，當培養基中的氮源耗盡后，進入發酵產膠階段。合適的氮源除了利于菌體的生長，還有利于合成黃原膠代謝過程所需酶類或者富含代謝途徑中酶催化反應前體物質。

氮源采用高核酸酵母時，產量最高，其次為（NH₄）₂HPO₄（見圖2）。高核酸酵母含有較多核酸類物質，有利于產物的合成。采用（NH₄）₂HPO₄為氮源時，發酵終點pH為5.8，較其他幾種氮源高。pH下降幅度較低，有利于代謝途徑中酶類保持活性。

3.4 初始pH對黃原膠產量的影響

丙酮酸的合成和CO₂氣體的放出會影響黃原膠的產量與糖基的活性，有數據表明，黃原膠更適合在中性培養環境下發酵生長[10]。采用磷酸鹽配制不同pH的緩沖液用于黃原膠發酵，當pH為7.2時，黃原膠的產量最高（見圖3）。