CTLA-4基因多態性與腎癌易感性的相關性研究

劉 琦 趙靈燕 程佳穎 周旭穎 隋 靜 高玉敏

腫瘤發生和發展的重要機制之一是免疫監視功能的損害[1]，而與免疫系統有直接聯系腫瘤之一是腎癌(renal cell cancer，RCC)。全球每年有超過10萬人死于腎腫瘤[2]，其中>90%是腎癌；我國腎癌發病死亡水平較低，但較以往有巨大上升[3]。細胞毒性T淋巴細胞抗原4(cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4，CTLA-4)基因存在于編碼免疫調節分子的染色體2q33上，由四個外顯子組成，它們編碼不同的功能結構域：先導序列、胞外結構域、跨膜結構域和胞質結構域[4]。此前的研究證據表明，CTLA-4在T細胞增殖和活化的負調控中起著關鍵作用，通過其在T調節細胞上的組成性表達間接控制效應T細胞[5]。然而，CTLA4也可能提高T細胞活化閾值，從而抑制抗腫瘤免疫，增加腫瘤易感性[6]。CTLA-4中的單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)與自身免疫性疾病和癌癥的易感性有關[7-8]。

此前的研究證實了CTLA-4基因多態性與多種癌癥[8-12]的易感性相關。到目前為止國內鮮有研究顯示CTLA-4基因多態性與腎癌的關系。本研究將探討CTLA-4基因rs5742909、rs231775位點與腎癌易感性的相關性。

1 資料與方法

1.1 研究對象

采用病例對照研究方法，于2018年至2019年分別收集內蒙古醫科大學附屬醫院和內蒙古自治區人民醫院新發腎癌患者96例，均經病理組織學確診，并以問卷調查的形式記錄人口學資料，排除其他腫瘤史者、患血液病及自身免疫病者、轉移而來的腎癌者、術前放療者。按照1∶1匹配原則，選擇對照人群96例，為同時期前來該醫院體檢中心期體檢的健康人群，均無惡性腫瘤史、血液病及自身免疫病史者。兩組人群性別、民族匹配，年齡相差3歲，且彼此之間無血緣關系。所有研究對象均簽署書面知情同意書，本研究獲內蒙古醫科大學倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 基因分型 按照DNA快速提取試劑盒(北京百泰克生物技術有限公司)的步驟從靜脈血中提取基因組DNA，并經紫外線分光光度計定量。上海生工生物工程股份公司預先設計了引物，對CTLA-4基因rs5742909、rs231775兩個位點進行擴增，采用多重高溫連接酶檢測反應技術(imLDR)技術對基因進行分型檢測。產物由上海天昊生物科技有限公司測序確認。

1.2.2 Hardy-Weinberg平衡 CTLA-4基因rs574290-9、rs231775位點在腎癌組和對照組人群中分布符合Hardy-Weinberg平衡定律(P=0.298、0.686)。

1.3 統計學分析

使用擬合優度χ2進行Hardy-Weinberg平衡檢驗，以方差分析或者χ2檢驗統計病例組與對照組之間的人口分布的特征及基因型頻率的差異，使用多因素條件Logistic回歸模型計算比值比(odds ratio，OR)和相應的95%可信區間(confidence interval，CI)來評估各基因型及有關因素與腎癌發病風險的關系。連鎖不平衡及單倍型分析使用SHEsis在線軟件。P<0.05時認為差異具有統計學意義。所有數據處理均使用SPSS 25.0統計軟件完成。

2 結果

2.1 研究對象基本情況

病例組年齡為(59.6±11.1)歲，男性59例，女性37例；對照組年齡為(60.2±11.2)歲，男性58例，女性38例。兩組間性別、年齡、葷素搭配、食用水果分布差異無統計學意義(P>0.05)；飲用牛奶和體育鍛煉行為的差異有統計學意義(P<0.01，表1)。

表1 病例組和對照組的一般情況比較(例，%)

2.2 基因型及等位基因頻率分布

rs5742909、rs231775位點基因型和等位基因頻率在兩組的分布差異均有統計學意義(P<0.05)，見表2。

2.3 條件Logistic回歸

將兩個位點及兩組差異具有統計學意義的飲用牛奶、體育鍛煉因素納入Logistic回歸模型中(表3)。結果表明，rs5742909位點及飲用牛奶進入模型，rs231775位點、體育鍛煉因素被剔除。其中飲用牛奶因素P=0.015，OR(95% CI)為2.65(1.212～5.779)，提示幾乎不飲用牛奶為患腎癌的危險因素。另外，在對照組中，rs5742909位點C等位基因的頻率較高[P=0.006，OR=0.443，95%CI 為(0.237～0.792)]；而在病例組中，rs231775位點A等位基因更為常見[P=0.009，Or=1.781，95%CI為(1.154～2.749)](表3)。

表2 CTLA-4基因2個位點基因型及等位基因頻率在病例組與對照組中的分布(例，%)

表3 Logistic回歸模型分析膀胱癌危險因素(例，%)

2.4 位點連鎖不平衡及單倍型分析

結果顯示，rs5742909與rs231775間的D’值為0.967，提示這兩個位點間存在強連鎖不平衡關系。CTLA-4基因兩個位點單倍型頻率分布比較可得，C-G和T-A兩個單倍型具有統計學意義(P=0.007、0.008)，在C-G和T-A單倍型分布下，患病風險分別為其他單倍型的0.556倍[OR(95%CI)為0.556(0.360～0.858)]和2.230倍[OR(95%CI)為2.230(1.216～4.089)，見表4。

表4 CTLA-4基因單倍型頻率分布差異(例，%)

3 討論

腎癌的發生發展涉及多種因素的參與作用，環境因素與遺傳因素的交互或共同作用是大多數腫瘤的病因，但暴露于相同環境的人群只有少數個體發病，提示個體的遺傳易感因素起更重要作用[3]。研究表明，慢性感染和炎癥是癌癥的主要病因，當炎癥免疫反應與腫瘤發生有關時，CTLA-4在活化的T細胞上的存在起著“關閉開關”的作用，以保持免疫系統處于正常狀態。CTLA-4可以被認為是1種“雙刃劍”，只有其最佳表達才能保證高效同時無害的免疫應答。CTLA-4基因在易患癌癥及自身免疫疾病的遺傳和環境易感性個體中的異常表達可能增加疾病發生和發展的風險[13]。考慮到單核苷酸多態性在CTLA-4基因表達蛋白質功能中的意義，假設這些SNPs參與腎癌的發生和發展。

基因多態性與乳腺癌、宮頸癌和慢性淋巴細胞白血病等多種惡性腫瘤的易感性有關[13]，但在腎癌中研究甚少。本研究評估了CTLA-4基因rs5742909與rs231775位點與中國漢族人腎癌易感性的關系，兩位點基因型和等位基因頻率在兩組的分布差異均有統計學意義(P<0.05)，但Logistic回歸結果尚未發現兩位點與腎癌易感性相關，rs5742909位點C等位基因在對照組中的分布頻率顯著高于病例組，可能與腎癌患病風險降低有關[P=0.006，OR(95% CI)為0.443(0.237～0.792)]。rs231775位點A等位基因在病例組的分布頻率顯著高于對照組，可能與腎癌患病風險增加有關[P=0.009，OR(95% CI)為1.781(1.154～2.749)]。

另外，本研究分析了病例組人群和對照人群在某些生活習慣如葷素搭配、飲用牛奶、食用水果、體育鍛煉情況的差異，Logistic回歸模型顯示，幾乎不喝牛奶或為腎癌的獨立危險因素，可使其患病風險增加2.646倍[(95%CI) 為(1.212～5.779)]。

本研究還分析了單倍型與腎癌的相關性，構建了CTLA-4基因2個位點的單倍型。C-G是對照組中最常見的單倍型，在病例組與對照組頻率分別為60.8%和74%，這種單倍型與腎癌患病風險降低約0.5倍相關。而在病例組中，T-A單倍型的頻率約為19%，而對照組不到10%，此單倍型與患腎癌的風險增加約2.5倍相關。即提示rs5742909C-rs231775G可能是腎癌患病的保護因素[OR(95%CI)為0.556 (0.360～0.858)]，而rs5742909T-rs231775A或為腎癌患病的危險因素[OR(95%CI)為2.230(1.216～4.089)]。

腎癌的發病率在世界范圍內呈上升趨勢，因此尋找影響腎癌發病風險、進展和療效的因素至關重要。本研究局限性在于樣本量較小，可能沒有足夠的統計能力探索兩者之間的真實關系。數據顯示CTLA-4多態性與中國人群腎癌患病風險無關，進一步研究更大的群體規模、多中心的臨床研究，結合臨床指標，從多角度闡明遺傳變異在CTLA-4基因和腎癌中的作用。