樂伐替尼靶向調(diào)節(jié)VEGFR/PI3K/AKT治療晚期甲狀腺癌的作用機(jī)制

王 寧 劉金彪

甲狀腺癌是發(fā)病率呈逐年上升的內(nèi)分泌系統(tǒng)的惡性腫瘤[1]，其發(fā)病機(jī)制尚未明確，主要包括碘的攝入不足和過量、接觸大量放射性碘或頸部放射線照射等引發(fā)的甲狀腺細(xì)胞的異常分裂及癌變，惡變?yōu)榧谞钕侔2-3]。甲狀腺癌主要包括分化型甲狀腺癌(DTC)、Hürthle細(xì)胞癌、甲狀腺髓樣癌(MTC)及未分化甲狀腺癌(ATC)，其中分化型甲狀腺癌又包括濾泡狀甲狀腺癌(FTC)及乳頭狀甲狀腺癌(PTC)，占甲狀腺癌比例的90%～95%[4-5]。研究表明，甲狀腺癌組織中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達(dá)明顯升高，在腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移和新生血管的形成過程中發(fā)揮重要作用[6]。本文主要通過給予晚期分化型甲狀腺癌患者新型多靶點(diǎn)酪氨酸激酶抑制劑(TKI)樂伐替尼治療，旨在探討樂伐替尼對晚期分化型甲狀腺癌的治療作用，及其誘導(dǎo)VEGFR靶向途徑聯(lián)合PI3K/AKT治療晚期甲狀腺癌的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2015年5月至2017年5月本院收治的100例晚期分化型甲狀腺癌患者，均經(jīng)病理學(xué)確診?；颊咂骄l(fā)病年齡(43.27±3.56)歲?；颊呖诜贩ヌ婺?，劑量為24 mg/d，直到出現(xiàn)無法耐受的副作用和疾病惡化。入選標(biāo)準(zhǔn)：①靶病灶完失去攝碘能力；②1年內(nèi)患者接受單次≥3.7 GBq放射碘治療，或一年內(nèi)每兩次放射碘治療≥3.7 GBq，靶病灶持續(xù)擴(kuò)展。排除標(biāo)準(zhǔn)：①半年內(nèi)使用過VEGFR-TKI小分子藥物；②具有吞咽困難、惡心嘔吐、慢性腹瀉、消化潰瘍、胃腸道出血和腸梗阻等腸道疾病者；③INR>1.5×ULN、APTT>1.5×ULN凝血功能異?；虺鲅獌A向者；④懷孕或哺乳期婦女。

1.2 方法

1.2.1 患者血清標(biāo)志物Tg檢測 采用Roche Elecsys 2010電化學(xué)發(fā)光全自動(dòng)免疫分析儀檢測2組患者治療前后血清中甲狀腺球蛋白抗體(TgAb)濃度。每份測3次取平均值，Tg同比下降率=(Tg-Tg基線)/Tg基線。

1.2.2 VEGFR2蛋白表達(dá)水平 取甲狀腺癌患者癌組織石蠟切片標(biāo)本，在室溫下采用5%血清進(jìn)行封閉40 min，然后加入堿性磷酸酶二抗、單克隆抗體VEGFR2在4 ℃下孵育。然后用PBS進(jìn)行清洗，然后加入SP和DAB在恒溫下顯色封片。用10×、40×物鏡顯微鏡進(jìn)行觀察。棕黃色顆粒在甲狀腺癌患者癌細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)為VEGFR2的陽性表達(dá)。計(jì)算VEGFR2蛋白的平均光密度。

1.2.3 Real-Time PCR檢測PI3K和AKT表達(dá)含量 對PI3K和AKT mRNA表達(dá)進(jìn)行Real-time PCR法檢測。采用Trizol法提取總RNA，然后轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量 PCR操作。采用閾值循環(huán)數(shù)(CT) 相對定量比較法確定不同組別之間PI3K和AKT mRNA相對百分比。

1.2.4 蛋白PI3K和AKT含量 收取甲狀腺癌組織蛋白，并且測定其濃度，將其總量調(diào)整為30 μg/μl。將各組甲狀腺癌蛋白樣品進(jìn)行電泳和轉(zhuǎn)膜，BSA封閉后加入PI3K和AKT一抗和堿性磷酸酶二抗。進(jìn)顯色并，然后再灰度掃描分析每條條帶，計(jì)算PI3K和AKT蛋白的表達(dá)量。

1.2.5 Caspase-3表達(dá)水平測定 收取甲狀腺癌組織的蛋白上清液并用緩沖液稀釋成50 μl，按試劑盒操作說明書在96孔板中加入5 μl 4 mM LEHD-pNA底物，37 ℃保溫箱恒溫孵育1 h，酶標(biāo)儀在405 nm處測定其蛋白溶液吸光值。Caspase-3活性單位(U)=(各組A值-凋零組A值)/標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率。

1.3 觀察指標(biāo)

臨床療效評價(jià)標(biāo)準(zhǔn):①完全緩解(complete remission,CR)，治療后持續(xù)1個(gè)月腫瘤完全消失；②部分緩解(partial remission,PR)，治療后腫瘤體積縮小達(dá)50%，持續(xù)1個(gè)月腫瘤及其他病變無擴(kuò)展；③穩(wěn)定(stable disease,SD)，治療后腫瘤體積持續(xù)1個(gè)月增大不超過25%，縮小不超過50%；④進(jìn)展(progressive disease,PD)，治療后腫瘤病變體積增大超過25%。有效=完全緩解(CR)+部分緩解(PR)，無效=穩(wěn)定(SD)+進(jìn)展(PD)。觀察2組治療前后Tg水平變化。比較甲狀腺癌癌旁組織與癌組織VEGFR2的平均光密度，PIiK和AKT及其蛋白的表達(dá)含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)比較，計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)比較。

2 結(jié)果

2.1 療效觀察

治療后完全緩解17例(17.00%)；部分緩解43例(43.00%)；穩(wěn)定20例(20.00%)；進(jìn)展20例(20.00%)。治療有效為60例(60.00%)，無效為40例(40.00%)。

2.2 患者血清Tg變化

治療前晚期分化型甲狀腺癌患者血清TgAb濃度為(87.65±12.31)IU/ml，治療1療程后患者血清TgAb濃度為(73.65±12.42)IU/ml；治療2療程后，患者血清TgAb濃度為(65.94±12.18)IU/ml。與治療前相比，晚期分化型甲狀腺癌應(yīng)用樂伐替尼治療后，患者血清TgAb濃度顯著下降，，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=48.010，P=0.000)?；颊咧委?療程Tg同比下降率為15.97%，治療2療程Tg同比下降率為24.77%。

2.3 免疫組化結(jié)果

如圖1，癌旁組織中VEGFR2蛋白平均光密度為(0.69±0.11)；治療后甲狀腺癌組織內(nèi)VEGFR2蛋白平均光密度為(1.24±0.20)，治療前VEGFR2蛋白平均光密度為(1.57±0.26)。治療后甲狀腺癌組織內(nèi)VEGFR2蛋白平均光密度明顯低于治療前，但仍高于癌旁組織(P<0.05)。

圖1 VEGFR2免疫組化結(jié)果(200×)

2.4 Caspase 3活性檢測結(jié)果

如圖2，甲狀腺癌組織內(nèi)Caspase 3活性比癌旁組織內(nèi)表達(dá)明顯上升(P<0.05)；晚期分化型甲狀腺癌患者應(yīng)用樂伐替尼治療后，Caspase 3活性顯著降低(P<0.05)。

注：*為與癌旁組織相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；#為與治療前相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.5 WesternBlot檢測蛋白表達(dá)水平

如圖3，與癌旁組織p-PI3K和p-AKT蛋白含量相比，甲狀腺癌組織內(nèi)p-PI3K和p-AKT蛋白含量明顯上升(P<0.05)；晚期分化型甲狀腺癌患者應(yīng)用樂伐替尼治療后，p-PI3K和p-AKT蛋白含量顯著降低(P<0.05)。

2.6 Real-Time PCR檢測mRNA表達(dá)含量

如圖4，甲狀腺癌組織內(nèi)PI3K和AKT mRNA表達(dá)含量比癌旁組織相比明顯上升(P<0.05)；晚期分化型甲狀腺癌患者應(yīng)用樂伐替尼治療后，PI3K和AKT mRNA表達(dá)含量顯著降低(P<0.05)。

3 討論

甲狀腺癌對一般藥物并不敏感，常規(guī)的治療主要是針對快速增長的癌細(xì)胞。樂伐替尼(lenvatinib)是一種多靶點(diǎn)酪氨酸激酶抑制劑(TKI)，能夠直接針對FGFR1-4、VEGFR1-3、RET、PDGFR和c-KIT等多靶點(diǎn)TKI，抑制腫瘤血管的形成和生長，起到抗腫瘤的作用[7-8]。臨床研究表明，樂伐替尼對BRAF或RAS野生型或突變的患者、放射性碘難治性疾病的患者、曾接受過 TKI 治療的患者及具有骨轉(zhuǎn)移灶的患者均有療效，緩解率高達(dá)50%，并且能夠延長無進(jìn)展生存期(PFS)[9-10]。2015年2月FDA已經(jīng)批準(zhǔn)將樂伐替尼用于治療晚期放射性碘難治性甲狀腺癌，是目前治療晚期分化型甲狀腺癌最新的分子靶向藥物。研究表明，樂伐替尼的靶向突出的療效可能與其特異性地抑制 VFGFR 有關(guān)[11-12]。

血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是由骨髓原始細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞分泌而來，VEGF家族包括 3 種酪氨酸蛋白激酶受體(VEGR1-3)及7 種糖蛋白(VEGFA-E 及PlGF1-2)。VEGF可通過受體磷酸化與 RTK 特異性結(jié)合，增加血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和存活及使血管通透性增加，誘導(dǎo)腫瘤血管的生成及增加血流量，加速腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[13-14]。樂伐替尼主要是通過競爭性抑制VEGFR來阻斷其與 VEGF結(jié)合，抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，以及新生血管生成等?；罨腜I3K/Akt可激活調(diào)控 VEGF、缺氧誘導(dǎo)因子1α及其他血管生成因子的表達(dá)和分泌等[15-16]。VEGF可反饋性地活化PI3K/AKT信號通路從而有助于血管的生成；反之，抑制VEGF及PI3K/AKT信號通路，可有效抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移，增加血管通透性，起到抑制腫瘤生長的作用[17-18]。

研究表明樂伐替尼治療晚期分化型甲狀腺癌的有效率為60.00%，療效顯著。甲狀腺球蛋白(Tg)在外周血液內(nèi)檢出量較少或無法檢測。當(dāng)甲狀腺發(fā)生病變時(shí)導(dǎo)致甲狀腺濾泡細(xì)胞結(jié)構(gòu)受到損傷，甲狀腺球蛋白被釋放進(jìn)入外周血，從而使甲狀腺激素的合成減少，加速機(jī)體甲狀腺功能的減退，因此，Tg的檢測對于評估、治療及分化型甲狀腺癌的預(yù)后具有重要的作用[19-20]。樂伐替尼可以有效調(diào)節(jié)患者血清TgAb濃度，說明其可以有效改善晚期分化型甲狀腺癌的甲狀腺損傷。同時(shí)，樂伐替尼可以有效降低和抑制晚期分化型甲狀腺癌患者組織內(nèi)VEGF及PI3K/AKT的信號表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖分化、浸潤遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡信號效應(yīng)性蛋白Caspase 3活化，加速腫瘤細(xì)胞的死亡，有效抑制癌細(xì)胞的增殖分化。

注：*為與癌旁相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；#為與治療前相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

注：*為與癌旁相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；#為與治療前相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

綜上所述，樂伐替尼可以有效治療晚期分化型甲狀腺癌，并調(diào)控VEGFR靶向途徑抑制PI3K/AKT信號通路，誘導(dǎo)甲狀腺癌細(xì)胞凋亡，起到治療晚期分化型甲狀腺癌的作用。