Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白-1、生長分化因子-15在結直腸癌患者中的表達及與臨床分期的相關性研究

周兵奇 苗 卓 王向征

結直腸癌是消化系統最常見的惡性腫瘤，發病率居惡性腫瘤的第3位。在我國結直腸癌居惡性腫瘤第4位，是導致死亡的主要腫瘤之一[1]。既往研究認為，腫瘤生物學行為(如局部浸潤、新血管生成及遠處淋巴結轉移等)在一定程度上受血清中腫瘤相關生物因子的調控，從而在一定程度上促進腫瘤的發生、發展[2]。近年來伴隨著結直腸癌分子治療的不斷發展，結直腸癌分子生物學研究成為熱點,近期研究稱血清中Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白-1(Kelch-like ECH-associated protein,Keap1)、生長分化因子-15(Growth differentiation factor 15,GDF 15)的表達能夠抑制腫瘤細胞的凋亡，從而促進腫瘤細胞的持續增殖，進而促進腫瘤的進展[3]。因此，本研究旨在探討Keap1、GDF 15在結直腸癌患者中的表達情況，以及其與臨床分期間的相關性，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象

研究收集2017年1月至2018年12月于我院接受治療的200例結直腸癌患者為實驗組。納入標準：① 經手術或病理活檢確診為結直腸癌的患者；②無心肺功能不全或其他嚴重疾病；排除標準：①臨床資料不全者；②伴有其他腫瘤的患者或非結直腸癌初診的患者。200例結直腸癌患者中，男性110例，女性90例；年齡45～74歲，平均約(59.37±7.29)歲；確診為直腸癌90例，結腸癌110例；淋巴結轉移 62例(其中N1 39例；N2 23例)，無淋巴結轉移138例；組織學分型：管狀腺癌160例，黏液腺癌40例；TNM分期：Ⅰ期 56例，Ⅱ期 44例，Ⅲ期 53例，Ⅳ期 47例。研究另收集200例結直腸息肉患者為結直腸良性病變組，男性105例，女性95例，年齡49～72歲，平均(58.67±7.44)歲。兩組患者間的性別、年齡比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。所有患者均在入組時詳細交代本研究目的及方法，患者表示對本研究知情并簽署知情同意書。

1.2 檢測方法

1.2.1 Keap1在結直腸癌中表達的測定 手術或活檢后的組織標本經10%甲醛固定后，常規石蠟包埋、切片，厚度為5 μm。采用免疫組化法檢測(兔抗人Keap1抗體購于美國proteintech公司，免疫組化二抗SP檢測試劑盒購于北京四正柏生物科技有限公司，Keap1抗體按1∶100稀釋)，剩下步驟嚴格按照試劑說明書進行操作，封片，鏡下觀察。根據觀察結果判斷Keap1表達情況，分別為陰性(-)、陽性(+)。

1.2.2 血清中GDF 15表達情況的測定 所有入組患者均于入院后第二天早晨空腹采集靜脈血5 ml，離心后取上層血清，至于-80 ℃冰箱中保存、備用。患者血清中GDF-15水平測定采用酶聯免疫吸附法，抗體購自美國proteintech公司，試劑盒購自北京四正柏生物科技有限公司。

1.3 評價指標

觀察兩組患者Keap1、GDF 15表達情況，比較兩組患者間及不同臨床特征結直腸癌患者Keap1、GDF 15表達差異。

1.4 統計學方法

研究應用SPSS 20.0軟件對所得數據進行統計學分析。計量資料以均數±標準差的形式記錄，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗及方差分析；計數資料以率(%)的形式記錄，組間比較采用χ2檢驗和Fish精確檢驗。Keap1、GDF 15表達情況與臨床分期間的相關性采用Spearman相關分析。以雙側P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者Keap1、GDF 15表達情況的比較

結直腸癌患者Keap1陽性表達率(80%)及血清中GDF 15表達水平[(1278.53±120.69)ng/l]均顯著高于結直腸良性病變組患者Keap1的陽性表達率(25%)及血清中GDF 15表達水平[(759.54±98.99)ng/l]，兩組間差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2 不同臨床分期結直腸癌患者Keap1、GDF 15表達情況的比較

研究發現伴隨著臨床T分期的進展，結直腸癌Keap1陽性表達率卻呈逐漸減低的趨勢，各分期間差異有統計學意義(P<0.05)；而不同N分期間結直腸癌Keap1陽性表達率差異無統計學意義(P>0.05)。至于血清中GDF 15的表達水平，則伴隨著T、N分期的進展而呈逐漸增高的趨勢，各組間差異有統計學意義(P<0.05),見表1。

2.3 不同病理類型結直腸癌患者Keap1、GDF 15表達情況的比較

研究發現不同病理類型結直腸癌患者Keap1陽性表達率均顯著高于結直腸良性病變組，但是在不同病理類型間Keap1陽性表達率無顯著差異(P>0.05)；而GDF 15在不同病理類型間表達水平有顯著差異(P<0.05)，見表2。

2.4 Keap1、GDF 15表達與結直腸癌臨床分期的相關性

Spearman相關分析表明，Keap1表達與結直腸癌臨床T分期有關(γ=0.327,P=0.014)；而血清中GDF 15表達水平與結直腸癌臨床T、N分期均有關(γ=0.457,P=0.002;γ=0.294,P=0.026)。

表1 不同臨床分期結直腸癌患者Keap1、GDF 15表達情況比較

表2 不同病理類型結直腸癌患者Keap1、GDF 15表達情況的比較

3 討論

直腸癌作為消化系統最常見的惡性腫瘤，盡管目前臨床結直腸癌治療方案眾多，但往往確診時病變的臨床分期均已是中晚期，造成結直腸癌的總有效率低，即使是手術聯合新輔助放化療等綜合治療措施的臨床緩解率亦較低[2]。隨著針對結直腸癌發生、發展機制的進一步研究，認為主要原因是對結直腸癌的早期發病過程缺乏有效的血清學指標。雖然目前臨床常用的腫瘤標志物(癌胚抗原、糖鏈抗原蛋白125等)能夠在一定程度上能夠提示腫瘤的存在，從而提高結直腸癌的診斷率，但其特異度較低，具有明顯的局限性[3-5]。因此，尋找1種高效、簡便、特異性高的結直腸癌血清學標志物，對于結直腸癌的診斷、治療均有重要的意義。

結直腸癌的發病機制復雜，遺傳因素、基因突變等均可能增加腫瘤的發生風險[6]。近年來，分子生物學水平的異常被認為是影響惡性腫瘤發生的核心因素，相關蛋白表達異常會增加腫瘤細胞擴散的風險，導致腫瘤細胞正常分化或促凋亡過程明顯失常[7-8]。因此，臨床上可能通過檢測某種分子指標而初步評估腫瘤病變的臨床分期。Keap1為近年來發現的分子標志物，其主要作用是機體對抗外界氧化和化學等刺激的防御性轉導通路，同時能夠通過與核因子E2 相關因子相互作用，活化抗氧化酶和蛋白，從而發揮抗氧化、抗炎以及抗腫瘤的作用[9-11]。本研究通過分析Keap1在結直腸癌中的表達發現：Keap1在結直腸癌中的陽性表達率明顯升高，分析其原因可能是由于Keap1有部分抗腫瘤的作用，當機體發生腫瘤性病變時，機體自身防御系統激活，導致Keap1陽性表達率升高。一項關于砷和Keap1誘導腫瘤的發病機制研究稱，砷能夠競爭性結合于Keap1下游的靶點核因子E2 相關因子，導致下游靶點的過度激活，從而導致Keap1表達水平下降，從而導致腫瘤細胞的增長[12]。上述研究也從另一方面驗證了Keap1對腫瘤細胞具有一定的抑制作用。而另一項關于Keap1與腦膠質瘤的研究表明：Keap1的表達不僅與神經膠質瘤的發病有關，還有腫瘤的惡性程度有關，研究認為Keap1的表達水平能夠在一定程度上反應腦膠質瘤的惡性程度[13]。這與本研究結果：伴隨著結直腸癌臨床T分期的進展，Keap1陽性表達率逐漸升高一致，說明Keap1在結直腸癌中的表達能夠在一定程度上反應腫瘤的臨床分期。

另外，本研究中的GDF 15屬于轉化生長因子家族成員，當前研究認為GDF 15在多種情況下均會不同程度增高，但是對于其表達水平與腫瘤生物學行為、分期的研究尙無明確研究[14]。有研究認為GDF 15作為多生物活性的細胞因子在腫瘤中扮演了多重角色，一方面抑癌基因激活GDF 15誘導腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤發生；然而在某些腫瘤中GDF 15 的高表達又與腫瘤的復發、轉移及低生存率相關[15-16]。本研究發現：結直腸癌患者血清中GDF 15表達水平顯著升高，說明GDF 15可作為結直腸癌患者的一項血清學檢測指標。有研究稱，結直腸癌患者血清內GDF 15升高的原因可能為：① 首先當前研究一致認為GDF 15為腸道黏膜的一種內源性保護因子；② GDF 15 對結直腸癌細胞具有明確的抑制作用，而且抗癌藥物能夠提高該因子的表達[17]。而本研究針對血清中GDF 15表達水平與結直腸癌臨床分期間的關系進行進一步的分析，本研究認為兩者間存在明確的相關關系。目前GDF 15在結直腸癌發生、發展中所起的作用尚無統一意見。既往有研究表明GDF 15能夠通過與轉化因子結合，從而促進結直腸癌的轉移，研究報道稱，血清CDF 15 表達水平與結直腸癌的進展有著一定的相關性，研究認為伴隨著結直腸病變的逐漸演變(由息肉-腺瘤-不典型增生-局灶性癌變-進展期腫瘤)，患者血清中的CDF 15水平逐漸升高[18]。另外還有部分研究結果表明：血清CDF 15水平可用于術后病情評估及腫瘤復發的檢測。因此，可以認為血清中GDF 15表達水平能夠在一定程度上促進腫瘤的進展。

綜上所述，本研究認為Keap1、GDF 15在結直腸癌中表達明顯增高，并與臨床分期存在明確的相關性，即臨床上可以通過檢測上述指標來評估腫瘤患者的臨床分期，為進一步的治療決策提供幫助。