基于腫瘤數據庫分析IGFBP5基因在結直腸癌中的表達及意義

張 聰 曹立宇

結直腸癌是消化系統惡性腫瘤之一，在我國惡性腫瘤致死率順位排名中居于第三位，多數結直腸癌患者在確診時已處于中晚期，5年生存率較低[1-2]。轉移和復發是結直腸癌患者的主要致死因素[3]。

胰島素樣生長因子結合蛋白家族(Insulin-like growth factor-binding proteins)包括IGFBP1-7共7個成員，這7個成員在新陳代謝中起著至關重要的作用，例如，胰島素抑制IGFBP1這是胰島素分泌的一個標志[4]。IGFBP5是該家族一員，在細胞生長、分化、凋亡和細胞代謝中發揮重要作用。有研究證明IGFBP5濃度與肥胖男性脂聯素濃度相關，提示IGFBP5可能參與代謝綜合征[5]。此外，IGFBP5的缺失導致輕度葡萄糖耐受不良和加重飲食誘導的肥胖[6]。并且IGFBP5參與前列腺癌、胃癌等多種腫瘤的發生發展[7-8]。

本研究通過分析GEPIA和Linked Omics數據庫，研究IGFBP5基因在結直腸癌中的表達水平與臨床參數的關系，分析IGFBP5與結直腸癌生存和預后的影響，并進一步探討IGFBP5參與結直腸癌發生發展的分子機制，以期對結直腸癌的初步診斷和臨床治療提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 病例資料

GEPIA2(gepia2.cancer-pku.cn)網站是1個分析腫瘤和正常樣本的在線工具，其數據來源TCGA和GTEx數據庫，它提供了可定制的功能，比如腫瘤/正常的微分表達式分析，可提供腫瘤患者腫瘤患者的臨床參數分析和生存分析等[9]。LinkedOmics數據庫包含來自TCGA數據庫的32種癌癥類型的多組學數據和臨床數據，共有11158名患者。它也是第一個集成了基于質譜(MS)的全球蛋白質組學數據的多組學數據庫，LinkedOmics主要有3個分析模塊，Link Finder板塊可以靈活地探索感興趣的分子或臨床屬性與所有其他屬性之間的關聯，并可進行分析和和可視化；Link Compare板塊可輕松比較LinkFinder識別出的關聯，這在多組學和全癌分析中特別有用；Link Interpreter板塊通過路徑和網絡分析將已識別的關聯轉換為生物學理解[10]。ONCOMINE包含65個基因表達數據集，包括超過4700個微陣列實驗的接近4800萬個基因表達測量值。可將大多數主要類型的癌癥與各自的正常組織以及多種癌癥亞型進行比較，基于臨床和病理學的分析可用于探索，可以查詢所有分析中選定基因或選定分析中多個基因的數據并可視化[11]。

1.2 IGFBP5表達分析

通過查閱ONCOMINE數據庫研究IGFBP5在多種腫瘤中的表達水平，結果顯示：IGFBP5基因在腦與中樞神經腫瘤、白血病、胰腺癌、肺癌和結直腸癌等多種腫瘤中表達水平上調。

使用RT-qPCR實驗驗證IGFBP5基因在結直腸癌中的表達。首先使用NCBI網站設計IGFBP5引物，上游序列：5'--3' ACCTGAGATGAGACAGGAGTC和下游序列5'--3' GTAGAATCCTTTGCGGTCACAA，設計內參GAPDH引物，上游序列5'--3' GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT和下游序列5'--3' GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG，退火溫度為60 ℃，按照TAKARA公司試劑盒進行實驗。38例結直腸癌組織及其配對組織來源于2014至2019年間在安徽醫科大學附屬阜陽醫院病理科做冰凍切片的剩余組織，所有病例均經病理診斷，并經患者及家屬知情同意。

1.3 臨床參數分析

使用LinkedOmics數據庫分析IGFBP5與結直腸癌臨床病理參數的相關性。本研究應用LinkFinder模塊分析IGFBP5的基因表達水平與結直腸癌的臨床病理特征的關系。操作步驟為：①腫瘤類型：選擇結直腸癌；②數據類型選擇RNAseq；③數據屬性：選擇IGFBP5；④靶數據類型：選擇Clinical；⑤統計學方法：選擇非參數檢驗。

1.4 生存分析

使用GEPIA2數據庫分析IGFBP5表達與結直腸癌患者總生存期和無病生存期之間的關系。操作步驟為：①輸入基因名IGFBP5；②點擊生存分析頁面，選擇總生存期/無病生存期；③選擇腫瘤類型結直腸癌(同時選取COAD和READ)；④點擊plot可視化分析，GEPIA使用Log-rank檢驗，即Mantel-Cox檢驗，用于假設檢驗，cox比例危險比和95%置信區間信息也可以包含在生存圖中。

1.5 基因集富集分析

使用LinkedOmics數據庫分析IGFBP5與結直腸癌臨床病理參數的相關性。本研究應用Link Interpreter板塊基于IGFBP5基因在結直腸癌中的表達水平進行GO和KEGG聚類分析。操作步驟為①腫瘤類型：選擇結直腸癌；②數據類型選擇RNAseq；③數據屬性：選擇IGFBP5；④靶數據類型：選擇RNAseq；⑤統計學方法：選擇Spearman相關性分析；⑥導出數據：導出結直腸癌中與IGFBP5表達顯著相關的前1000位基因；⑦分析：使用DAVID網站進行GO和KEGG聚類分析。

1.6 IGFBP5相關基因靶點網絡和蛋白互作網絡圖

應用Cytoscape 3.6.1軟件構建IGFBP5相關基因靶點網絡，同時使用STRING數據庫檢索IGFBP5共表達蛋白，并構建IGFBP5分子調控網絡，將二者結果取交集，得出與IGFBP5基因關聯最緊密的基因。

1.7 統計學方法

應用SPSS 13.0軟件對數據進行統計學分析。應用配對t檢驗分析IGFBP5在結直腸癌組織和癌旁組織中的表達水平，使用χ2檢驗分析IGFBP5與結直腸癌臨床病理參數之間的相關性，使用Log-rank檢驗法分析IGFBP5表達與結直腸癌患者生存之間的相關性，基因富集分析結果中認為P<0.05且FDR(false discovery rates)<0.25的基因集為顯著富集基因集。所有數據以P<0.05時認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 IGFBP5在結直腸癌組織中表達水平升高

通過查閱ONCOMINE數據庫，發現IGFBP5基因在中樞神經系統腫瘤、乳腺癌、結直腸癌、肺癌、前列腺癌和淋巴瘤中表達水平升高(P<0.05)。采用RT-qPCR實驗檢測IGFBP5在38例結直腸癌組織及其配對組織中的表達，得到了一致的結果(P<0.05)(圖1)。

2.2 IGFBP5在結直腸癌中的表達水平與其臨床病理參數的相關性

選擇LinkedOmics數據庫分析IGFBP5在結直腸癌中與其臨床病理參數的相關性，結果顯示：IGFBP5與結直腸癌N分期(n=373)顯著相關(P=0.025)，而與腫瘤分級(n=358)、T分期(n=375)和M分期(n=306)均無顯著相關性(P>0.05)(圖2)。

2.3 IGFBP5表達與結直腸癌患者預后的相關性分析

本研究應用GEPIA2數據庫進行生存分析，結果顯示在結直腸癌中，IGFBP5高表達組(n=135)總生存期較IGFBP5低表達組(n=135)明顯降低(P=0.014)，其中HR=1.8，P(HR)=0.016；結直腸癌中IGFBP5高表達組(n=135)無病生存期較IGFBP5低表達組(n=135)明顯降低(P=0.0082)，其中HR=1.9，P(HR)=0.0095(圖3)。

2.4 IGFBP5的功能基因集富集

在Linkedomics數據庫導出結直腸癌中與IGFBP5相關的前1000位相關基因，采用DAVID網站分析IGFBP5的分子功能和相關信號通路，GO分析結果顯示：IGFBP5在結直腸癌中與細胞黏附、血管生成和血管內皮生長因子等多種促癌功能有關，KEGG分析結果顯示：IGFBP5基因與PI3K-Akt信號通路激活有關(表1)。

2.5 IGFBP5共表達基因分析

為獲得與富集所得生物學功能和相關信號通路相關的潛在上下游分子，我們使用Cytoscape 3.6.1軟件構建IGFBP5相關基因靶點網絡，同時使用STRING數據庫檢索IGFBP5共表達蛋白，并構建IGFBP5分子調控網絡，將二者結果取交集，結果顯示在IGFBP5共表達基因中，IGF1、IGF2、SPP1、LTBP1和FAM20C基因與IGFBP5基因關聯最緊密。

圖3 IGFBP5表達與結直腸癌患者總生存期(左)和無病生存期(右)的相關性分析

3 討論

胰島素樣生長因子5(IGFBP5)位于人類染色體2q35上，編碼含272個氨基酸殘基的多通道跨膜蛋白，分子量30.5 kDa，是體內生長激素的1個重要調節因子[12]。有關IGFBP5的生物學功能研究較少，有研究證明IGFBP5濃度與肥胖男性脂聯素濃度相關，提示IGFBP5可能參與代謝綜合征[5]。此外，IGFBP5的缺失導致輕度葡萄糖耐受不良和加重飲食誘導的肥胖[6]。并且IGFBP5參與前列腺癌、胃癌等多種腫瘤的發生發展[7-8]。

近年來IGFBP5在腫瘤中的研究逐漸展開，Neuzillet等[13]研究發現，IGFBP5在膀胱癌中通過抑制IGF1R信號通路促進腫瘤細胞增殖能力和遷移能力，進而促進了膀胱癌的發生發展。Sun等[14]研究發現circPIP5K1A通過靶向miR-661/IGFBP5軸促進卵巢癌進展，支持其作為該疾病治療的候選靶點的實用性。啟動子甲基化可引起該基因的沉默，IGFBP5基因啟動子區甲基化水平在胃癌中明顯高于癌旁組織，進一步證實IGFBP5可作為胃癌的表觀遺傳學標記物[15]。然而也有研究者發現，在黑色素瘤中，IGFBP5表現相反，抑制腫瘤細胞的生長和遷移[16]。因此，在不同的腫瘤中，由于腫瘤之間發生機制的差異性，IGFBP5可能有著不同的作用。本研究結果顯示相對于正常癌旁組織，IGFBP5在結直腸癌組織中表達水平顯著性，進一步分析發現IGFBP5與結直腸癌N分期呈顯著性正相關，而與T分期、M分期和腫瘤分級并無顯著相關性，即IGFBP5表達水平越高的結直腸癌患者腫瘤的淋巴結轉移水平越高，提示IGFBP5的表達促進結直腸癌細胞的轉移，可能是結直腸癌的促癌因子。生存分析也證實了IGFBP5是結直腸癌的不良預后因素，IGFBP5表達水平與結直腸癌總生存期和無病生存期具有顯著負相關性。因此IGFBP5的表達可能促進結直腸癌的發生發展。腫瘤的發生發展影響因素及其復雜，在正常結直腸癌惡變的過程中，多伴有細胞的黏附水平降低以及血管生成水平的變化[17-18]，而PI3K-Akt信號通路抑制腫瘤細胞的凋亡以及促進增殖有關，是腫瘤發生發展過程中一個重要的信號通路[19-20]。本研究通過GO分析，發現IGFBP5的表達可促進細胞黏附、血管生成和血管內皮生長因子等多種促癌功能，提示IGFBP5可能對結直腸癌上皮細胞的惡變具有促進作用，KEGG分析結果顯示IGFBP5表達與PI3K-Akt信號通路激活有關，參與腫瘤發生發展的調控。通過分子互作網絡分析，我們篩選出了IGF1、IGF2、SPP1、LTBP1和FAM20C等IGFBP5共表達基因，其中IGFI、IGF2是IGFBP5的重要調控因子[21]，而SPP1是PI3K-Akt信號通路上游調控因子[22]。由此可以推測IGFBP5很可能是同坐作用于SPP1，間接激活PI3K-Akt信號通路，從而促進結直腸癌的發生和發展。

表1 基因富集結果

本研究的創新之處在于利用網絡數據庫中具有完整臨床資料的病例，樣本量大，結合基礎實驗驗證可信度高，然而不足之處也很明顯，無論是GEPIA2還是LinkedOmics數據庫提供的都是IGFBP5基因mRNA水平的表達數據，無法檢測IGFBP5在結直腸癌中的蛋白表達水平。本研究為以后IGFBP5在腫瘤中的臨床研究提供了理論基礎，明確IGFBP5在結直腸癌乃至整個腫瘤中所起的作用和具體分子機制尚需要進一步的實驗，展開更深入的研究，從而為腫瘤的早期診斷、臨床治療和預后知道提供靶向新思路。