沉默CCND1基因表達(dá)抑制ERK/MAPK信號(hào)通路激活提升宮頸癌化療敏感性

鄭 懿 李希聰 趙太坤 姜 敏

宮頸癌是婦科最常見惡性腫瘤，僅次于乳腺癌[1]。早期宮頸癌治療以手術(shù)為主，而晚期患者治療多采取放化療[2]。化療抵抗[3]導(dǎo)致進(jìn)展期患者治療效果不佳，患者預(yù)后差、易復(fù)發(fā)。CCND1基因已被發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞增殖分化中作用顯著，其異常高表達(dá)可促進(jìn)如卵巢癌、乳腺癌的發(fā)生發(fā)展[4-5]。同時(shí)，ERK/MAPK作為廣泛研究的一類具有促癌作用的信號(hào)通路，已被報(bào)道在介導(dǎo)多類癌細(xì)胞增殖遷移及化療抵抗中作用突出[6]。基于此，本研究重點(diǎn)關(guān)注并首次研究調(diào)控CCND1基因表達(dá)介導(dǎo)ERK/MAPK信號(hào)通路在宮頸癌化療敏感性的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

本研究實(shí)驗(yàn)對(duì)象選取2017年3月至2019年3月期間我院婦科收治的行手術(shù)切除的宮頸癌患者，共計(jì)60例。所有患者均經(jīng)術(shù)后病理學(xué)檢查確診為宮頸癌，術(shù)前均未接受放化療及其他治療，且均提供有完整詳細(xì)臨床資料。患者年齡32～68歲，平均(47.83±8.22)歲；年齡<40歲 31例，≥40歲 29例；Ⅰ期13例，Ⅱ期16例，Ⅲ期20例，Ⅳ期11例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移36例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移24例；鱗癌45例，腺癌15例。術(shù)中切取適量的宮頸癌癌灶組織樣本及配對(duì)的臨近癌旁組織。采集組織一部分經(jīng)福爾馬林液固定后制石蠟包埋切片用于免疫組化檢測(cè)；另一部分癌組織和癌旁組織標(biāo)本放入液氮冷凍保存，鋁箔包裹進(jìn)行研磨，采用Trizol試劑反復(fù)洗滌，經(jīng)DEPC水處理后凍存收集，置于液氮中，以提取RNA行PCR檢測(cè)。本研究經(jīng)所有納入合格患者知情同意，并經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)實(shí)施。

1.2 免疫組化檢測(cè)

組織切片常規(guī)二甲苯脫蠟、梯度酒精脫水，3%雙氧水室溫下作用15 min，PBS沖洗15 min。山羊血清37 ℃封閉20 min后棄血清，滴加一抗兔抗人CCND1抗體，4 ℃過夜。PBS洗滌3次。二抗為羊抗兔IgG抗體，37 ℃孵育30 min。免疫組化一抗和二抗均購于abcam公司(Cambridge，MA，USA)。PBS沖洗3次后滴加SABC(博士德生物工程有限公司，武漢，中國)，37 ℃孵育30 min，后進(jìn)行DAB顯色，蘇木精染色，二甲苯透明。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及篩選

人宮頸癌細(xì)胞株Siha、Caski、Hela、S3均購自中國科學(xué)院腫瘤研究所。RPMI 1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)懸浮細(xì)胞，接種 0.5×105/ml于 24孔板，置于5% CO2培養(yǎng)箱中溫育。視細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，每隔2～3 d傳代培養(yǎng)一次。合適細(xì)胞株的篩選基于CCND1表達(dá)的qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果。

1.4 細(xì)胞分組

基于細(xì)胞篩選結(jié)果，將所述細(xì)胞轉(zhuǎn)染分組如下：Blank組，pcDNA-CCND1組(轉(zhuǎn)染CCND1過表達(dá)質(zhì)粒)，pcDNA-CCND1 NC組(轉(zhuǎn)染CCND1過表達(dá)NC質(zhì)粒)，siRNA-CCND1組(轉(zhuǎn)染siRNA-CCND1質(zhì)粒)，siRNA-CCND1 NC組(轉(zhuǎn)染siRNA-CCND1 NC質(zhì)粒)，SCH772984組(轉(zhuǎn)染SCH772984，ERK抑制劑)，Honokiol組(轉(zhuǎn)染Honokiol，ERK激動(dòng)劑)，siRNA-CCND1+Honokiol組(共轉(zhuǎn)染siRNA-CCND1質(zhì)粒和Honokiol)。通過qRT-PCR檢測(cè)其轉(zhuǎn)染效率。

采用Lipofectamine Transfection Reagent 2000(Invitrogen，USA)介導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)染。稀釋質(zhì)粒，制備A液；稀釋Lipofectamine 2000，制備B液；混合A液和B液，作為細(xì)胞轉(zhuǎn)染液體，每孔細(xì)胞中加入100 μl轉(zhuǎn)染液，輕輕搖勻。轉(zhuǎn)染6 h更換成完全培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞。

1.5 CCK8檢測(cè)順鉑耐藥性

順鉑使用前采用10%FBS制備為不同溶度的溶液(共設(shè)6個(gè)濃度0、3、6、9、12、15 μg/ml)并儲(chǔ)存4 ℃?zhèn)溆谩Ｈ?duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，調(diào)整細(xì)胞密度為2×104/ml。5%CO2培養(yǎng)箱細(xì)胞溫育6 h后，將各濃度梯度順鉑依次加入96孔板中，設(shè)3個(gè)復(fù)孔。設(shè)置空白對(duì)照。48 h后，每孔加新配10 μl CCK8試劑(上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司，上海，中國)，繼續(xù)孵育4 h后終止。于波長(zhǎng)450 nm處使用酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀測(cè)定各孔吸光度值，計(jì)算細(xì)胞存活率以反映細(xì)胞的順鉑耐藥性。

1.6 qRT-PCR檢測(cè)CCND1、ERK和MAPK mRNA表達(dá)水平

轉(zhuǎn)染48 h后，收集各組細(xì)胞，Trizol法提取細(xì)胞總RNA。設(shè)計(jì)CCND1、ERK、MAPK和GAPDH引物，交由上海生工設(shè)計(jì)并合成。逆轉(zhuǎn)錄體系20 μl，參照TaqMan MicroRNA Assays Reverse Transcription Primer進(jìn)行操作，42 ℃下逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)30 min，85 ℃并逆轉(zhuǎn)錄酶失活反應(yīng)5 s。參考參照SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒說明書，取反應(yīng)液進(jìn)行熒光定量PCR。程序設(shè)置為兩步法，設(shè)置95 ℃擴(kuò)增1 min變性后，再設(shè)置35周期：95 ℃變性5 s，61 ℃退火延伸 30 s。目的基因以GADPH為內(nèi)參。采用相對(duì)定量法計(jì)算，用2-ΔΔCt表示各目的基因相對(duì)表達(dá)量。組織中CCND1、ERK和MAPK mRNA表達(dá)水平同上操作步驟。

1.7 Western blot檢測(cè)CCND1、ERK和MAPK蛋白表達(dá)

收集轉(zhuǎn)染培養(yǎng)48 h后的各組宮頸癌細(xì)胞。加入RIPA裂解液，輕搖重懸后，冰上孵育30 min，4 ℃下12 000 r/min離心10 min，取上清液，即為細(xì)胞總蛋白。利用碧云天BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。取20 μg細(xì)胞總蛋白用10 % SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，隨后濕法轉(zhuǎn)膜，使用5%的脫脂奶粉封閉1.5 h。按照抗體說明書稀釋相應(yīng)抗體于一抗稀釋液中。實(shí)驗(yàn)所用的一抗如下：CCND1、ERK和MAPK，及兔抗人GAPDH多克隆抗體(內(nèi)參)；加入相應(yīng)HRP標(biāo)記的二抗羊抗兔IgG抗體，室溫反應(yīng)2 h。所有抗體均購于Abcam公司(Cambridge，MA，USA)。ECL發(fā)光液顯色后曝光成像。應(yīng)用Quanity One軟件進(jìn)行蛋白條帶灰度分析。

1.8 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡變化

細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化，1 500 r/min離心10 min，棄上清，加入預(yù)冷70%乙醇固定細(xì)胞，4 ℃過夜。流式細(xì)胞術(shù)過程中采用Annexin V-FITC/PI 雙標(biāo)染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡，將處理好的細(xì)胞置于5%CO2培養(yǎng)箱中室溫培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，離心重懸，加入10 μl Annexin V-FITC(Abcam公司，Cambridge，MA，USA)和5 μl PI輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15 min，加入300 μl結(jié)合緩沖液，用流式細(xì)胞儀以激發(fā)波長(zhǎng)488 nm檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 CCND1、ERK和MAPK在宮頸癌中高表達(dá)

通過對(duì)60例宮頸癌組織及相應(yīng)癌旁組織進(jìn)行qRT-PCR，發(fā)現(xiàn)相比于癌旁組織，癌組織中CCND1、ERK和MAPK表達(dá)均顯著升高(P均<0.05)(圖1A)。

免疫組化檢測(cè)癌組織和癌旁組織CCND1的表達(dá)(圖1B)，CCND1蛋白定位處顯色為棕黃色或者黃褐色，主要定位于細(xì)胞質(zhì)，相比于癌旁組織(12/60，20.00%)，癌組織(47/60，78.33%)中CCND1陽性表達(dá)顯著升高(P<0.05)。

A為qRT-PCR檢測(cè)宮頸癌組織及癌旁組織CCND1、ERK和MAPK的表達(dá)；B為CCND1在癌組織和癌旁組織中表達(dá)陽性率。*為表示與癌旁組織相比，P<0.05。

2.2 CCND1對(duì)ERK/MAPK信號(hào)通路的調(diào)控關(guān)系

四組宮頸癌細(xì)胞株中Siha細(xì)胞株的CCND1表達(dá)量均最高(圖2A)。所以選擇Siha細(xì)胞株用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

qRT-PCR檢測(cè)Siha細(xì)胞株中CCND1對(duì)ERK/MAPK信號(hào)通路的調(diào)控關(guān)系，如圖2B、C所示。Blank組和pcDNA-CCND1 NC組、siRNA-CCND1 NC組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。相比Blank組，pcDNA-CCND1組CCND1、ERK、MAPK基因和蛋白表達(dá)顯著增加；而siRNA-CCND1組CCND1、ERK、MAPK基因和蛋白表達(dá)均顯著降低(P均<0.05)。而與siRNA-CCND1組相比，siRNA-CCND1+ Honokiol組CCND1表達(dá)水平降低(P<0.05)，而ERK和MAPK表達(dá)水平無顯著變化(P均>0.05)。結(jié)果提示說明CCND1過表達(dá)和沉默表達(dá)細(xì)胞轉(zhuǎn)染的成功；且提示CCND1表達(dá)可能調(diào)控ERK/MAPK的表達(dá)。

2.3 抑制ERK/MAPK信號(hào)通路激活促進(jìn)細(xì)胞的凋亡和提升化療敏感性

分別采用流式細(xì)胞術(shù)和MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Siha細(xì)胞株中各組細(xì)胞凋亡能力和順鉑敏感性，如圖3所示。結(jié)果顯示，與Blank組相比，Honokiol組癌細(xì)胞細(xì)胞凋亡降低，順鉑敏感性呈濃度依賴性降低(P均<0.05)；SCH772984組癌細(xì)胞細(xì)胞凋亡升高，順鉑敏感性呈濃度依賴性升高(P均<0.05)。說明抑制ERK能夠促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的凋亡并提高宮頸癌順鉑敏感性。

A為細(xì)胞株篩選；B為相關(guān)基因表達(dá)量；C為相關(guān)蛋白表達(dá)量；*為與pcDNA-CCND1 NC組相比，P<0.05；#為與siRNA-CCND1NC組相比，P<0.05。

A為不同組別細(xì)胞凋亡；B為不同組別細(xì)胞凋亡率；C為不同順鉑濃度下細(xì)胞存活率；*為與Blank組相比，P<0.05。

2.4 沉默CCND1表達(dá)通過抑制ERK/MAPK信號(hào)通路激活促進(jìn)細(xì)胞的凋亡和提升化療敏感性

基于上述結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)假設(shè)CCND1通過ERK促進(jìn)細(xì)胞的凋亡和耐藥。基于MTT實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖4)，Blank組、pcDNA-CCND1 NC組、siRNA-CCND1 NC組間細(xì)胞凋亡及耐藥性無顯著差異(P均>0.05)。與pcDNA-CCND1 NC組相比，pcDNA-CCND1組癌細(xì)胞凋亡率降低，順鉑敏感性呈濃度依賴性降低(P均<0.05)；與siRNA-CCND1 NC組相比，siRNA-CCND1組癌細(xì)胞凋亡率升高，順鉑敏感性呈濃度依賴性提升(P均<0.05)。而與siRNA-CCND1組相比，siRNA-CCND1+ Honokiol組癌細(xì)胞凋亡率降低，順鉑敏感性呈濃度依賴性降低(P均<0.05)，與Blank組間差異不顯著(P均>0.05)。說明CCND1能夠通過ERK促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的凋亡并提高宮頸癌細(xì)胞化療敏感性。

注：A為不同組別細(xì)胞凋亡；B為不同組別細(xì)胞凋亡率；C為不同順鉑濃度下細(xì)胞存活率；*為與pcDNA-CCND1 NC組相比，P<0.05；#為與siRNA-CCND1 NC組相比，P<0.05。

3 討論

腫瘤的形成機(jī)制復(fù)雜，涉及多種因素的相互作用；腫瘤患者不良預(yù)后及死亡與腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性(如侵襲、轉(zhuǎn)移和凋亡)等密切相關(guān)[7]。同時(shí)，腫瘤患者化療敏感性的提高已成為提升療效的關(guān)鍵途徑之一。

本研究中，我們通過體內(nèi)乳腺癌組織實(shí)驗(yàn)確認(rèn)CCND1、ERK和MAPK的表達(dá)；并經(jīng)體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，探究CCND1基因表達(dá)介導(dǎo)ERK/MAPK信號(hào)通路激活在宮頸癌細(xì)胞凋亡及化療敏感性方面的作用及相關(guān)聯(lián)機(jī)制。本研究通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，以期深入探究原癌基因沉默介導(dǎo)關(guān)聯(lián)信號(hào)通路在宮頸癌發(fā)生發(fā)展及診療的作用，為頸癌治療提供思路參考。

既往已有眾多研究關(guān)注ERK/MAPK信號(hào)通路激活和抑制激活在人類腫瘤中的作用[8-9]。ERK和MAPK是細(xì)胞內(nèi)一類保守絲-蘇氨酸蛋白激酶，入核后可調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子活性，從而誘導(dǎo)相關(guān)基因表達(dá)。已知ERK和MAPK在胃癌、卵巢癌、肝癌等中均存在異常高表達(dá)[10-12]。同時(shí)，CCND1基因作為重要的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白，其轉(zhuǎn)錄因子活性的激活，可導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生發(fā)展[13]。本研究體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：與癌旁組織相比，宮頸癌中CCND1、ERK和MAPK呈高表達(dá)，提示該基因和信號(hào)通路在宮頸癌中的促癌作用，并初步證實(shí)本文假設(shè)沉默CCND1基因表達(dá)介導(dǎo)ERK/MAPK信號(hào)通路激活可能抑制宮頸癌發(fā)展并提高化療敏感性。

為進(jìn)一步確認(rèn)CCND1基因與ERK/MAPK信號(hào)通路的關(guān)聯(lián)，本文構(gòu)建Blank組、pcDNA-CCND1組、pcDNA-CCND1 NC組、siRNA-CCND1組、siRNA-CCND1 NC組共計(jì)5個(gè)組別，發(fā)現(xiàn)沉默CCND1表達(dá)可抑制ERK/MAPK信號(hào)通路的激活。同時(shí)siRNA-CCND1+ Honokiol組別的和建議，進(jìn)一步佐證CCND1沉默表達(dá)在抑制所述信號(hào)通路激活的作用，為后文作用機(jī)制探究奠定基礎(chǔ)。MTT實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)CCND1基因表達(dá)和采用SCH772984誘導(dǎo)ERK/MAPK信號(hào)通路激活可提升細(xì)胞凋亡率和腫瘤細(xì)胞化療敏感性；而沉默CCND1基因表達(dá)和采用Honokiol抑制ERK/MAPK信號(hào)通路激活可降低細(xì)胞凋亡率和化療敏感性。該結(jié)果分別提示：沉默CCND1基因表達(dá)和抑制ERK/MAPK信號(hào)通路激活均可發(fā)揮抑癌作用和提升化療敏感性的作用；且Honokiol干預(yù)可逆轉(zhuǎn)沉默CCND1基因表達(dá)的作用。同時(shí)，鑒于CCND1可調(diào)控ERK和MAPK的表達(dá)，筆者推測(cè)沉默CCND1基因表達(dá)在宮頸癌中的抑癌和化療敏感性作用可能與抑制該信號(hào)通路激活相關(guān)。與沉默CCND1基因表達(dá)處理相比，CCND1表達(dá)沉默結(jié)合Honokiol處理導(dǎo)致癌細(xì)細(xì)胞凋亡降低，順鉑耐藥性增加。證實(shí)CCND1基因沉默能夠通過抑制ERK/MAPK信號(hào)通路激活促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的凋亡并提高細(xì)胞化療敏感性。

綜上所述，本研究首次證實(shí)CCND1基因沉默表達(dá)可能通過抑制ERK/MAPK信號(hào)通路的激活，促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞凋亡，并提高化療敏感性。本研究可為增強(qiáng)宮頸癌化療敏感性提供分子生物學(xué)依據(jù)，有待進(jìn)一步動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。