絲裂霉素抑制PI3K-AKT-mTOR信號通路對前列腺癌小鼠原位細胞移植模型的作用與機制研究

常俊鍇 侯俊清 朱朝陽 李曉東 李鐵強 徐衛波 趙小磊 趙振華 劉 輝

前列腺癌是男性泌尿系統最常見的惡性腫瘤之一，在全世界范圍內尤其是歐美地區為高發區[1]。目前臨床上對于前列腺癌主要采用內分泌治療，但是長期治療中隨著前列腺癌細胞向著雄激素非依賴性前列腺癌細胞的轉變，會使得常規內分泌治療失效[2]。雷帕霉素靶蛋白(mTOR)作為1種絲氨酸/蘇氨酸激酶，其參與了多條信號通路傳導，mTOR可磷酸化真核細胞起始因子,進而調控細胞增殖和細胞凋亡[3]。PI3K-AKT-mTOR信號通路在前列腺癌細胞中的異常活化有助于增加腫瘤細胞的耐藥性，促進腫瘤細胞的存活[4-5]。臨床前研究結果顯示，明確靶向PI3K-AKT-mTOR信號通路的抑制劑在多種腫瘤中具有明確的藥理學效應[6]。因此選擇性抑制PI3K-AKT-mTOR信號通路可作為1種新型的治療前列腺癌的方案。

本研究中我們在小鼠前列腺原位種植前列腺癌細胞株RM-1,人工制備前列腺癌小鼠原位細胞移植模型，該模型能夠較好的模擬人轉移性前列腺癌，可用于抗癌藥物的篩選。選擇PI3K-AKT-mTOR信號通路及其臨床常用抗生素類化療藥物絲裂霉素作為治療藥物。研究絲裂霉素在治療RM-1原位移植小鼠前列腺癌腫瘤模型中的作用與機制。

1 材料與方法

1.1 細胞培養

自ATCC購買小鼠前列腺癌細胞株RM-1，生長于10%GIBCO胎牛血清RPMI1640完全培養基中，在5%CO2、37 ℃條件下培養，每3天傳代一次。使用0.25%的胰蛋白酶消化傳代細胞，選取狀態好且處于對數生長期的細胞，消化后1 500 rpm離心收集細胞沉淀，用PBS重懸細胞，反復3次，最后一次重懸細胞后細胞計數，稀釋配置成1.0×108個/ml細胞懸液，使用臺盼藍染色在顯微鏡下檢測活細胞比率大于95%。

1.2 動物分組

于揚州大學比較醫學中心購買50只10周齡的C57BL/6雄性小鼠，實驗動物合格證號：SCXK(蘇)2007-0001。體重24～26 g，飼養于SPF級鼠房，小鼠可自由攝取食物和無菌飲用水，待小鼠適應環境之后，隨機分為對照組、假手術組、模型組和絲裂霉素高低給藥組，每組10只小鼠。

1.3 動物造模

所有小鼠在造模前按3.5 μl/g體重10%水合氯醛麻醉小鼠，將小鼠腹部朝上固定于無菌手術臺上，切開下腹部顯露出腹腔，在10倍顯微鏡下進行精細操作，找到小鼠膀胱和生殖腺之后向兩側推開，暴露前列腺，除對照組和假手術組外所有小鼠用微量注射器分別向兩側前列腺側葉注射RM-1細胞懸液10 μl，觀察到包膜鼓起并脫離腺體為注射成功標志，假手術組小鼠在前列腺同一位置注入等體積的PBS溶液，對照組小鼠只進行開腹手術，恢復所有移動臟器的位置后縫合小鼠腹部切口，待小鼠蘇醒后給予正常飼料和無菌飲水。本研究采用治療給藥方式，原位造模后第二天開始高低給藥組分別按0.2 ml/20 g體重腹腔注射1、2 mg/kg的絲裂霉素PBS溶液，對照組、假手術組和模型組分別腹腔注射相同體積的PBS，每周給藥兩次。每天定時記錄小鼠體重變化和小鼠狀態，連續治療14天。小鼠出現蜷縮，體溫下降等瀕死狀態時經眼眶取血后脫頸處死小鼠，記錄為時間和體重，取小鼠各個臟器及前列腺組織。取前列腺原位癌組織，量取癌組織體積，取各臟器檢測前列腺癌轉移情況。

1.4 檢測指標

記錄所有組別小鼠在前列腺癌細胞原位移植造模前和造模治療期間體重變化趨勢，制作體重變化率曲線。同時記錄每組每只小鼠活動狀態，根據小鼠疾病活動指數標準評價每組小鼠活動狀態。

記錄所有小鼠死亡時間，制作所有組小鼠死亡率曲線。

測定每組中所有小鼠原位前列腺癌組織大小，繪制瘤體積散點圖。

使用ELISA試劑盒檢測小鼠血清中前列腺癌特異性抗原。鑒定原位移植模型中前列腺癌轉移狀態，及藥物干預對前列腺癌的轉移率的影響作用。

提取小鼠前列腺組織RNA，使用q-PCR法檢測PI3K-AKT-mTOR信號通路關鍵蛋白基因表達水平，檢測不同組別小鼠前列腺組織及其前列腺癌組織中基因差異性表達。

使用western blot法檢測PI3K-AKT-mTOR信號通路中關鍵調控蛋白的表達水平，研究PI3K-AKT-mTOR信號通路在前列腺癌細胞小鼠原位移植模型中的作用及其給藥干預后PI3K-AKT-mTOR信號通路在治療中的角色。

1.5 統計學方法

應用SPSS 20.0統計軟件對數據進行統計處理。實驗數據用平均值±標準差表示，多個樣本均數間比較采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 小鼠體重變化率

除對照組小鼠之外，所有小鼠經歷了麻醉后開腹腔和前列腺原位注射手術，在術后兩天內小鼠體重均有所下降，從第三天開始假手術組小鼠體重開始顯著回升，兩個給藥組小鼠體重下降率略低于模型組小鼠，在造模后期模型組體重下降最多，其次是低劑量和高劑量給藥組，假手術組小鼠體重接近于對照組小鼠。

2.2 絲裂霉素治療對前列腺癌小鼠疾病活動指數(DAI)評分的影響

從結果來看：模型組小鼠DAI評分高達(5.4±0.72)，顯著高于對照組(0.15±0.13)和假手術組(0.3±0.21)(P<0.05),絲裂霉素干預治療組小鼠DAI指數顯著下降，與模型組相比差異顯著(P<0.05)。這說明絲裂霉素能夠改善荷瘤小鼠生存狀態和活動狀態，見表1。

表1 絲裂霉素治療對前列腺癌小鼠DAI評分的影響

2.3 小鼠死亡率比較

在小鼠原位前列腺癌細胞移植模型中，在無菌操作臺及SPF飼養條件下小鼠沒有出現感染死亡案例，在手術操作及小鼠麻醉過程中低劑量組出現了1例死亡，統計所有小鼠在原位注射麻醉蘇醒后小鼠自然死亡案例，其中對照組和假手術組沒有小鼠死亡，原位注射的模型組在不同時間段出現了5只死亡，實驗結束時死亡率為50%，低劑量組出現了4只死亡，死亡率為40%，高劑量出現了3只死亡，死亡率為30%，同時絲裂霉素治療組小鼠死亡多發生在造模中后期，且死亡率較模型組具有較大的差異。具體結果如下圖1所示。

圖1 每組小鼠死亡率結果曲線

2.4 小鼠前列腺腫瘤體積散點圖

此次小鼠前列腺原位腫瘤移植模型中，模型組小鼠腫瘤體積顯著增加，絲裂霉素治療組小鼠原位腫瘤體積顯著小于模型組(P<0.05)，說明絲裂霉素能夠有效的抑制小鼠原位腫瘤生長，減輕小鼠的腫瘤負荷。具體結果見圖2所示。

圖2 小鼠前列腺腫瘤體積散點圖

2.5 小鼠血清前列腺癌特異性抗原檢測

檢測結果顯示：模型組小鼠血清中前列腺癌特異性抗原濃度遠大于對照組，具有顯著性差異(P<0.05)，兩個絲裂霉素給藥組小鼠血清前列腺癌特異性抗原含量較模型組顯著下降(P<0.05)，但仍高于對照組小鼠。具體見下表2。

表2 每組小鼠前列腺癌特異性抗原濃度

2.6 PI3K-AKT-mTOR信號通路相關蛋白基因表達情況(表3)

與對照組相比，模型組小鼠前列腺原位腫瘤中PI3K、AKT和mTOR基因的mRNA水平顯著上調(P<0.05)，給藥治療基因表達水平較模型組顯著下調(P<0.05)，但仍沒有達到對照組水平。

表3 PI3K-AKT-mTOR信號通路相關蛋白基因表達水平

2.7 小鼠前列腺原位移植瘤中PI3K-AKT-mTOR信號通路相關蛋白檢測

western bloting檢測結果見圖3，結果顯示，模型組中AKT和mTOR總蛋白水平較對照組顯著下降(P<0.05)，同時模型組中p-AKT和p-mTOR水平顯著上升(P<0.05)，說明在小鼠原位前列腺癌模型中PI3K-AKT-mTOR信號通路處于激活狀態，給藥治療后AKT和mTOR總蛋白水平較模型組顯著上升(P<0.05)，同時給藥組中p-AKT和p-mTOR水平顯著降低(P<0.05)，說明絲裂霉素治療后能夠有效的抑制原位前列腺癌移植模型中PI3K-AKT-mTOR信號通路的過度激活。量化western blotting結果見圖4。

圖3 小鼠前列腺原位移植瘤中PI3K-AKT-mTOR信號通路相關蛋白表達水平

3 討論

前列腺癌在歐美國家的發病率和死亡率均處于常見惡性腫瘤前列，在我國隨著生活方式的改變，前列腺癌在近些年逐漸成為泌尿系統最主要的疾病。在前列腺癌發生發展中雄性激素具有重要的作用，前列腺癌前期治療中阻斷雄性激素作用明顯，但是在治療后期極易復發，轉變為雄性激素非依賴性前列腺癌，增加治療的難度[7]。同時前列腺癌在明確診斷時患者往往已經發生了全身性轉移，前列腺腫瘤的原位診斷和轉移腫瘤的異質性均在很大程度上增加了患者的死亡率[8]。

P13K-Akt-mTOR信號通路參與細胞周期進程、通過AKT可調控細胞凋亡相關蛋白，從而抑制細胞凋亡，在前列腺癌中抑癌基因PTEN的失活能夠促進血管生成相關基因的過度表達，增加腫瘤組織的血管形成.由此可見過度激活的P13K-Akt-mTOR信號通路在前列腺癌的發生發展中具有重要的作用[9-11]。絲裂霉素作為一種細胞周期非特異性藥物，其能夠有效的抑制DNA復制，進而阻滯細胞周期和細胞增殖[12]。絲裂霉素目前主要在臨床上用于治療消化道腫瘤或者和化療藥物聯合治療轉移性肺癌和胃癌。本研究中采用前列腺原位注射小鼠前列腺癌細胞株RM-1，構建小鼠前列腺移植腫瘤模型，選擇臨床化療藥物絲裂霉素作為研究藥物，原位注射模型小鼠隨著腫瘤細胞種植時間的推移，出現明顯體重下降，至造模結束，小鼠體重僅為初始體重的68%，同時化療治療組小鼠體重后期呈現下降減緩趨勢，說明絲裂霉素能夠有效的抑制前列腺癌細胞株原位注射造成的小鼠荷瘤負擔。這與Thomas[13]的研究具有相似的結果。前列腺癌作為一種高發病率和致死率的男性常見惡性腫瘤，存活時間和存活率是評價治療有效性的重要指標，正如我們研究結果所示：小鼠經原位注射前列腺癌細胞株后，在兩周時間內模型組出現了50%的死亡率，這符合前列腺癌高致死的基本特征，而絲裂霉素干預治療組小鼠死亡率明顯下降，同時小鼠的疾病活動指數也顯著下降，這提示我們絲裂霉素能夠顯著改善荷瘤小鼠的生存狀況，有助于降低小鼠死亡率。絲裂霉素作為一種臨床常用化療藥物，其抑制細胞周期的作用已被廣泛證明。本研究中絲裂霉素干預治療能夠有效的抑制腫瘤體積，減輕小鼠荷瘤負擔。前列腺癌是一種難確診易轉移的惡性腫瘤，很多死亡患者均伴有不同程度的腫瘤轉移，本研究中我們檢測了前列腺癌血清轉移指標前列腺癌特異性抗原，我們發現在模型組中小鼠血清中含有高濃度的前列腺癌特異性抗原，這提示在原位注射模型中小鼠體內前列腺癌發生了明顯的轉移，而干預治療組前列腺癌特異性抗原濃度顯著下降，說明絲裂霉素能夠有效的抑制原位前列腺癌的全身性轉移。綜上結果可知，絲裂霉素能夠改善小鼠的荷瘤生存狀況，這很有可能是基于絲裂霉素能夠抑制原位前列腺癌細胞的增殖，顯著的阻滯前列腺癌的全身性轉移。基于此，我們研究了與細胞周期、細胞凋亡和腫瘤血管生成相關的P13K-Akt-mTOR信號通路，已有研究表明P13K-Akt-mTOR信號通路在前列腺癌中是出于顯著激活狀態，能夠促進腫瘤增殖和腫瘤組織血管生成。我們檢測了小鼠前列腺及其前列腺癌組織P13K、Akt和mTOR蛋白的基因表達水平，我們發現其基因表達水平顯著上調，這與Mathews的[14]研究結果相似，我們也檢測了相應的蛋白表達水平，同時量化分析了磷酸化蛋白的表達變化，其結果與基因表達相似，在原位前列腺癌模型中P13K-Akt-mTOR信號通路處于顯著激活狀態，絲裂霉素干預治療能夠有效的抑制P13K-Akt-mTOR信號通路的激活[15-17]，鑒于此我們認為絲裂霉素可能是通過調節P13K-Akt-mTOR信號通路進而影響前列腺癌的發生與發展。

圖4 小鼠前列腺原位移植瘤中PI3K-AKT-mTOR信號通路相關蛋白表達水平定量分析

綜上所述：本研究發現絲裂霉素能夠通過抑制腫瘤細胞周期進而阻滯腫瘤體積變大，同時絲裂霉素化療治療能夠延長荷瘤小鼠有效生存期，絲裂霉素能夠通過抑制P13K-Akt-mTOR信號通路的激活調節腫瘤細胞的增殖。