超聲引導下經皮滑膜射頻消融術在兔AIA模型中的短期療效觀察

徐 琦 朱張茜 劉澤政 朱建碧 劉靈川 丁歡歡 鄭 潔 金純純

關節滑膜增生是多種關節疾病的共同病理生理過程，尤其是在類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis, RA)中，滑膜炎促進免疫活性細胞釋放多種炎性細胞因子、蛋白水解酶、膠原酶等，對軟骨、韌帶、肌腱等關節結構造成持續性的影響，并導致關節畸形[1]。RA的內科治療主要使用改善病情藥物(disease-modifying antirheumatic drugs，DMARDs)，全身RA在DMARDs的控制下趨于穩定，但局部仍活動的關節滑膜炎癥導致了全身的炎癥復發[2，3]。外科治療目前主要使用關節鏡下滑膜切除術，但該術式較難全面清除增生的滑膜組織[4]。超聲引導下經皮射頻消融術是一種有效滅活淺表局部腫瘤組織的微創治療方式，創傷小、恢復快，因此可試用于治療關節滑膜增生性疾病，該治療方法目前報道少，療效尚不清楚[5，6]。本研究使用經皮射頻消融術治療AIA模型兔膝關節滑膜增生，并觀察了該術式的短期療效。

材料與方法

1.實驗動物：本研究所用的日本大耳白兔由溫州醫科大學動物實驗中心提供，共計40只3～6月齡雄性清潔級日本大耳白兔，體質量為1.7～2.7kg。

2.分組：①RFA組：以AIA動物模型法進行造模后，隨機選擇一側膝關節接受射頻消融術治療，共15只[7]；②非RFA組：以AIA動物模型法進行造模后，不做治療干預，共15只；③對照組：以0.9%NaCl注射液局部注射作為對照，隨后不經任何干預正常飼養，共10只。

3.試劑與器具：卵清白蛋白(OVA，美國Sigma公司)，弗氏完全佐劑(美國Sigma公司)，TRIzol試劑(美國Invitrogen公司)，cDNA RT-PCR試劑盒(美國Invitrogen公司)，SYBR Premix Ex Taq試劑盒(日本TaKaRa公司)。超聲造影劑使用SonoVue(意大利Braco公司)，加入5ml 0.9%NaCl注射液震蕩至均勻，造影時經兔耳緣靜脈團注0.1ml，隨后注射1ml 0.9%NaCl注射液；射頻消融儀器(美國Covidien公司)，射頻消融針型號為Cool-tip ACT1510，治療時按60W等額輸出功率。

4.超聲儀器與參數：采用GE LOGIQ E9型超聲診斷儀，使用ML6-15線陣探頭進行灰階和能量多普勒超聲檢查，探頭頻率7.0MHz，PWr-15dB，機械指數(MI)0.35，使用配備超聲造影軟件的9L線陣探頭進行超聲造影檢查，頻率GEN 7.0MHz，PWr-15dB，機械指數(MI)0.35，輸出能量10%。造影前調節增益至適當水平。

5.制作AIA關節炎模型步驟：基礎致敏：20mg/ml的OVA 0.9%NaCl注射液1ml在兔肩胛間區5個不同部位皮下注射，連續2周，每周1次，第3周使用10mg/ml OVA與弗氏完全佐劑1∶1乳劑1ml在兔肩胛間區5個不同部位皮下注射；膝關節注射：第5周使用10mg/ml的OVA乳劑各1ml注射在兔雙側膝關節髕韌帶兩側。造模成功標準：膝關節紅、腫、熱、關節僵硬、活動受限；超聲顯示雙側膝關節滑膜增生厚度均至少達到4mm。

6.滑膜射頻消融術操作過程：以2%戊巴比妥鈉1.5ml/kg兔耳緣靜脈麻醉，剃毛、消毒后進行滑膜超聲造影，觀察滑膜增強情況。多點連續移動消融法(moving shot)逐步消融滑膜組織，軟骨、重要肌腱旁滑膜組織以“杠桿撬離法”做為應對，完成后即刻再次超聲造影，觀察有無殘留活性的滑膜組織及是否存在周圍軟組織的誤消融區，如有殘存活性滑膜區域，重復射頻消融至消融完全[8，9]。由固定人員射頻消融術擔任消融手術者及助手。

7.術后處理與評價：RFA術后消融處冰敷2h，前3天予16萬單位/毫升青霉素2.5ml肌內注射預防感染。術后第1、3、7、14天進行術后觀察，測量兔體質量、膝關節徑、超聲評價滑膜最大厚度、滑膜炎評分，滑膜炎按0～3分法進行半定量評分[10]。第14天處死動物，髕旁內外并橫斷韌帶聯合切口解剖膝關節，肉眼觀察雙膝關節滑膜、軟組織損傷黏連、軟骨與骨侵蝕情況。按Okura等[11]法取下髕下脂肪墊組織，在30000×g下離心20min，采用TRIspin法從髕下脂肪墊組織中提取總RNA，反轉錄成cDNA RT-PCR，測定兔TNF-α、VEGF mRNA，引物序列參照Reno等[12]的研究。根據Zagariya等[13]的方法Western blot法檢測蛋白質提取物中的TNF-α、VEGF水平。

結 果

1.AIA動物模型建立情況：3組共40只日本大耳白兔體質量為1.73～2.68kg，平均體質量為2.22±0.24kg，3組間體質量單因素方差分析結果比較，差異無統計學意義(F=0.437，P>0.05)。所有動物在造模與飼養過程中無死亡情況，其中26只一次性造模達到造模標準，其余4只在膝關節補注射1次OVA與弗氏完全佐劑1∶1乳劑1周后達到成模標準。

2.射頻消融術與術后情況：15只RFA組兔耳緣靜脈麻醉順利，麻醉后對RFA組進行術前超聲檢查及CEUS(圖1)，滑膜組織CEUS動脈期滑膜組織與周邊肌肉組織對比呈高增強、均勻增強(12/15，80%)，少數兔滑膜組織CEUS呈等增強、不均勻增強(3/15，20%)，實質期滑膜組織緩慢消退。周邊積液區域呈始終無增強的充盈缺損區。在超聲引導下采用逐步法對滑膜組織進行射頻消融并以CEUS作為評價標準(圖1C～F)，11例一次性消融完全(73.33%)，其余4例在第2次消融后CEUS提示為消融完全(圖1F)。15例RFA組兔術中未出現與手術相關的死亡現象。

3.RFA術后短期療效觀察：RFA組兔治療一側膝關節術后3天內出現較明顯的腫脹情況(圖2A)。3組兔體質量變化及膝關節周徑變化對比詳見圖3。同飼養周期時RFA組、非RFA組體質量低于對照組，RFA組兔在滑膜消融術后體質量平穩；術前同飼養周期RFA、非RFA 兩組關節周徑均大于同期對照組(P均<0.01)，RFA組在消融術后第3天關節周徑達到最大值，隨后逐漸減低，在術后第3、第7天RFA組與非RFA組、對照組比較，關節周徑差異有統計學意義(P均<0.01)，在第14天測量時與非RFA組比較，差異無統計學意義。

圖3 RFA組兔RFA術后與其他兩組兔體質量與膝關節周徑隨時間變化曲線圖

非RFA組滑膜厚度與滑膜炎評分隨時間無顯著變化(P均<0.01)，而RFA組在消融術后滑膜厚度減低，與非RFA組比較,術后第7、14天比較差異有統計學意義(P均<0.01，圖4A)。滑膜炎評分在術后顯著減低，與非RFA組比較,術后第3、7天時差異有統計學意義(P均<0.01,圖4B)，術后第14天兩組間比較，差異無統計學意義。

圖4 RFA組與非RFA組兔膝關節超聲測定滑膜厚度與滑膜炎半定量評分隨時間變化曲線圖

同期飼養的白兔在相當于RFA組術后第14天時處死，3組間髕下脂肪墊測定TNF-α、VEGF mRNA比較詳見表1和圖5。RFA組兔關節TNF-α、VEGF mRNA表達水平與非RFA組、對照組比較差異均有統計學意義(P均<0.05)；非RFA組與對照組以上3種細胞因子水平比較，差異均有統計學意義(P均<0.01)。RFA組術后TNF-α、VEGF水平呈現下降趨勢，但仍高于對照組。

表1 兔髕下脂肪墊組織總RNA測定TNF-α、VEGF mRNA的3組間比較

圖5 兔髕下脂肪墊測定TNF-α、VEGF mRNA表達3組間比較

討 論

關節滑膜增生常見于多種關節疾病，在RA中滑膜增生促進了炎性細胞因子的過度產生，導致關節喪失功能[1]。隨著超聲引導下熱消融治療的不斷成熟與進步，超聲引導下滑膜射頻消融術也成為了一種潛在的有效治療手段，本研究利用AIA模型模擬RA滑膜增生病理生理過程，使用RFA術對滑膜組織進行治療，并觀察其短期療效。

AIA模型成模穩定，本研究中RFA組與非RFA組30只日本大耳白兔均造模成功[7]。在對同飼養周期3組實驗動物體質量及關節徑觀察表明(圖3)，RFA組兔術后體質量平穩，未出現顯著的由于滑膜消融帶來的進食方面的影響，主要的術后影響出現在膝關節腫脹方面，在術后第3天，RFA組兔膝關節周徑達到峰值，與其他兩組兔比較，差異有統計學意義(P均<0.01)，隨后關節腫脹情況逐漸恢復，至術后第14天，RFA組兔膝關節周徑與非RFA組比較，差異無統計學意義(P>0.01)，并且觀察到在術后第14天時，兔膝關節活動情況已基本恢復至術前水平。因此可以認為在膝關節滑膜RFA術對機體的影響是短暫的、可以恢復的。該種表現類似于在人體其他淺表部位腫瘤行RFA治療時的表現[5，6]。

在滑膜RFA術療效觀察方面，術后超聲定期觀察評價表明RFA組術后滑膜厚度隨時間的延長而減低，并在術后第7、14天時其與非RFA組比較，差異有統計學意義(圖4)。而滑膜炎評分在術后顯著減低，在術后14天內未出現復發，可以認為RFA術在短期內對于滑膜增生的滅活效果是值得肯定的。而非RFA組在飼養至相當于RFA組術后第2周末時開始出現滑膜炎評分的自發降低表現，提示AIA模型滑膜炎可能出現了自愈現象。

RFA術對于關節內的炎性微環境影響方面，髕下脂肪墊TNF-α、VEGF mRNA表達水平(表1，圖5)。表明RFA組關節TNF-α、VEGF mRNA水平與非RFA組同期比較呈下降趨勢(P均<0.05)，但仍高于對照組(P均<0.01)。雖然RA是一種病因不明的慢性全身炎性疾病，但TNF-α已被證明在RA及其他多種自身免疫性疾病的發病機制中起著核心作用[14]。TNF-α刺激滑膜間充質干細胞(MSCs)的增殖和軟骨細胞破壞，并誘導其他促炎性細胞因子的釋放，導致關節破壞[15，16]。而在本研究中RFA術抑制了TNF-α、VEGF的表達，是一種有潛力抑制關節滑膜增生與關節破壞的治療手段。

有研究表明，RFA術在治療原發性肝細胞癌時，RFA誘導的抗腫瘤免疫反應使大量T細胞浸潤到腫瘤中，增強了CC趨化因子配體3的活性作用，并通過增強增強宿主免疫反應起到抗腫瘤的作用[17，18]。另有研究顯示，RFA術比手術切除能夠更好地誘導并增強宿主免疫反應[19]。本研究結果表明，滑膜射頻消融術似乎可以通過免疫調節的方式抑制關節炎的程度，但是通過本研究尚不能說明其機制如何，滑膜RFA術是否也誘導了關節內的免疫調節尚不得而知，或者僅是因為滅活的滑膜組織限制了關節內的炎性細胞因子表達，值得進一步探討。

超聲引導下膝關節滑膜射頻消融術是一種潛在的能夠治療關節滑膜增生的微創治療手段，在AIA兔動物模型實驗研究中治療效果良好，治療后能夠有效地清除有活性的滑膜組織，并且在動物實驗中關節炎性細胞因子TNF-α、VEGF的表達得到了有效的抑制，但本研究的樣本量較少，且尚不明確炎性細胞因子表達抑制的病理生理機制。