RANKL、OPG、NF-κBp65蛋白表達在牙齦癌中臨床意義

秦 晗 龔永慶 徐宏志

牙齦癌發生率高且易早期侵犯頜骨引起骨質破壞，目前主要以手術切除為主配合放化療，治療效果欠佳[1]。近年發展起來的靶向治療因在多種腫瘤中療效顯著已使其成為新的有效治療手段[2]。研究牙齦癌發生過程中分子機制，尋找有效治療靶點，對于牙齦癌的徹底治療具有重要意義。核因子-κB受體活化因子配體(RANKL)屬于腫瘤壞死因子超家族成員，通過與核因子-κB受體活化因子(RANK)結合，促進破骨細胞分化成熟，發揮骨吸收作用。骨保護蛋白(OPG)是誘餌受體，與RANKL結合后可阻斷RANKL/RANK結合[3,4]。局部微環境中RANKL和OPG表達的相對水平即RANKL/OPG比值是決定破骨細胞形成和活性的關鍵，若比值升高，則破骨細胞形成活躍，反之則破骨細胞形成受抑[5]。

近年來RANKL與腫瘤之間關系引發關注，研究表明，大多數腫瘤細胞中RANKL處于持續性激活狀態，抑制RANKL可阻止腫瘤生長和腫瘤轉移引起的骨質破壞，因此認為RANKL與腫瘤的發生、分化、侵襲和轉移密切相關，可作為腫瘤診斷標志物和有效治療靶點[6]。NF-κB是重要轉錄因子，主要以p65/p50二聚體形式與抑制因子(I-κB)綁定并長期處于細胞質中。當細胞膜受體相應配體刺激后，I-κB激酶通過泛素-蛋白酶體通路介導I-κB復雜磷酸化，使p65/p50二聚體被釋放進入細胞核，從而啟動對目標基因的轉錄[7,8]。NF-κBp65參與NF-κB通路激活的經典和非經典通路中，被視為NF-κB通路激活的重要證據。本研究將RANKL、OPG、NF-κBp65蛋白和RANKL/OPG比值變化作為研究對象，以期揭示牙齦癌的發生可能與RANKL過表達后激活NF-κBp65，進而通過NF-κB通路正反饋機制引起牙齦上皮細胞異常分化相關。

材料與方法

1.主要材料：牙齦癌臨床標本(徐州醫科大學附屬連云港醫院)、牙齦癌和牙齦上皮細胞系(中國科學院上海細胞庫)、胎牛血清(上海威正翔禹生物科技有限公司)、免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物科技有限公司)、BCA 蛋白檢測試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司)、蛋白質預染標志物(上海賽默飛世爾有限公司)、ECL-PLUS試劑盒(上海賽默飛世爾有限公司)、SDS-PAGE 蛋白電泳儀(上海天能科技有限公司)、蛋白轉膜儀(上海天能科技有限公司)、離心機(上海賽默飛世爾有限公司)、倒置顯微鏡(上海蔡康光學儀器有限公司)、生物安全柜(上海振樣創科技有限公司)、CO2培養箱(日本三洋貿易株式會社)。

2.免疫組化檢測臨床標本：收集2018年7月～2019年12月筆者醫院診治的牙齦癌標本，制備組織切片，脫蠟至水，染色前60℃放置1h。按試劑盒說明進行免疫組化染色，分別加入RANKL[小鼠，美國Proteintech公司，66610-1-Ig，1∶500，(35～38)kDa]、OPG(兔，英國Abcam公司，ab9986，1∶500，56kDa)、NF-κBp65(兔，美國CST公司，#8242，1∶100，65kDa)多克隆抗體，4℃冰箱過夜，標本徹底清洗后加入稀釋好的兔抗或鼠抗IgG抗體(兔，美國CST公司，#7074，1∶2000，小鼠，#7076，1∶2000)孵育30min。蘇木精復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明,中性樹膠封片,顯微鏡下觀察RANKL、OPG、NF-κBp65蛋白表達并分析RANKL/OPG比值。

3.牙齦癌細胞和牙齦上皮細胞培養：從液氮罐中取出購自中國科學院上海細胞庫的人牙齦癌細胞和牙齦上皮細胞凍存管，完全解凍后，1300r/min，離心3min。而后吸去上清，加入MEM培養基重懸細胞，晃勻后置于37℃、5%CO2培養箱進行細胞培養。24h后更換培養液，待細胞匯合度達80%左右傳代。繼續培養至細胞對數生長期時，用胰蛋白酶消化制成(3～5)×104個/毫升單細胞懸液，以2×104/cm2的密度接種到相應培養板，繼續培養24h。

4.Western blot法檢測RANKL、OPG、NF-κBp65蛋白表達:收集牙齦癌和牙齦上皮細胞，PBS 洗滌，2×Lysis Buffer裂解，4℃、12000r/min、離心15min，而后取上清，BCA 法測定蛋白濃度。根據目的蛋白大小配制不同濃度膠，采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠法進行電泳。電泳結束后，使用轉移電泳裝置，4℃、300mA 恒流電轉150min，將蛋白轉移到PVDF膜上。分別將稀釋好的RANKL(1∶2000)、OPG(1∶2000)、NF-κBp65(1∶500)多克隆抗體(廠家批號同免疫組化)與封閉好的PVDF 膜孵育過夜。徹底清洗后再將稀釋好的兔抗或鼠抗IgG(1∶2000)抗體(廠家批號同免疫組化)與PVDF 膜孵育1.5h。再次清洗PVDF 膜后X線顯影、定影、晾干、結果分析。內參為GAPDH(小鼠，上海SANTA CRUZ生物技術有限公司，sc-32233，1∶2000，36kDa)。

5.統計學方法：應用SPSS 19.0統計學軟件對實驗組和對照組數據進行t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.免疫組化結果：分別在實驗組牙齦癌細胞核和細胞質中見到棕色沉淀分布,RANKL、OPG在細胞質中強陽性表達，NF-κBp65在細胞核中強陽性表達。對照組免疫組化染色弱陽性(圖1)。與對照組比較，RANKL、OPG、NF-κBp65蛋白表達及RANKL/OPG比值升高，差異有統計學意義(P<0.05，圖2、圖3)。

圖1 免疫組化法檢測牙齦癌蛋白表達(×200)

圖2 免疫組化檢測牙齦癌蛋白表達統計學分析

圖3 免疫組化法檢測RANKL/OPG蛋白比值統計學分析

2.Western blot法檢測結果:與對照組比較，實驗組RANKL、OPG、NF-κBp65蛋白表達均升高(圖4)。與對照組比較，RANKL、OPG、NF-κBp65蛋白表達及RANKL/OPG比值升高，差異有統計學意義(P<0.05，圖5、圖6)。

圖4 Western blot法檢測牙齦癌細胞RANKL、OPG、NF-κBp65蛋白表達結果

圖5 Western blot法檢測牙齦癌細胞RANKL、OPG、NF-κBp65蛋白表達統計學分析

圖6 Western blot法檢測RANKL/OPG蛋白比值統計學分析

討 論

RANKL是腫瘤壞死因子超家族成員，存在膜結合和分泌型兩種形式,可與破骨前體細胞RANK相結合，誘導破骨細胞成熟。以往研究認為，RANKL參與骨代謝、免疫、心血管等多種生理病理過程，近年來RANKL與腫瘤間關系越發受到重視[9,10]。大量研究表明，大多數腫瘤細胞中RANKL處于持續性激活狀態，因此認為RANKL與腫瘤發生、發展密切相關，這將為相關疾病治療提供新的思路和方法。通過對多發性骨髓瘤研究發現，在骨髓瘤細胞和骨髓間質細胞內均可見RANKL表達升高[11]。乳腺癌研究中提示RANKL升高可能與乳腺癌細胞表達或誘導多種促進骨代謝因子，致使骨髓基質細胞大量產生RANKL有關[12]。通過臨床標本和體外培養的牙齦癌細胞研究顯示，牙齦癌細胞中RANKL表達較對照組明顯升高，提示同大多數腫瘤一樣，牙齦癌中RANKL也處于激活狀態，這為本研究的最初設想即將RANKL作為牙齦癌的治療靶點提供有效的實驗依據。

OPG作為誘餌受體，主要功能是抑制破骨細胞分化、成熟，并誘導其凋亡。作用機制為直接抑制RANK/RANKL復合體活性，或者通過與RANK競爭性結合RANKL，間接抑制骨吸收以及OPG獨立于RANKL直接抑制破骨細胞活性，抑制骨吸收[13,14]。人體內骨代謝平衡或失調更多取決于RANKL/OPG比值，而不是RANKL或OPG絕對含量值，比值降低，破骨細胞分化和活性降低，反之則升高。介于RANKL和OPG相互拮抗作用，因此觀察RANKL/OPG比值變化較單獨觀察RANKL和OPG變化更有意義[15]。本研究對臨床標本和體外培養牙齦癌細胞中OPG蛋白檢測發現，與對照組比較，實驗組OPG蛋白表達升高，但牙齦癌中RANKL/OPG比值仍高于對照組。此結果提示當RANKL和OPG表達量均升高而骨吸收沒有被相應抑制時，可能是因為牙齦癌細胞中RANKL表達遠遠高于OPG的表達，即RANKL/OPG比值增加的緣故。

NF-κB調節免疫球蛋白κ輕鏈在B淋巴細胞中的表達，若失調易導致各種惡性腫瘤發生，因此，很多研究著力于探索實體瘤中NF-κB表達的臨床意義，以提示疾病預后[16]。NF-κB主要以p65/p50二聚體形式存在于細胞內，未激活時，NF-κB與I-κB結合，存在于細胞質中，若受到細胞膜外信號刺激，I-κB激酶復合體將I-κB磷酸化，使NF-κB暴露核定位點。游離的NF-κB迅速移位到細胞核，誘導相關基因轉錄[17]。NF-κB信號通路可以被RANKL等炎性介質激活，其活化后也可以作為外界刺激因子進一步活化NF-κB，形成NF-κB自身活化的正反饋機制[18]。p65參與NF-κB激活的經典和非經典通路，被視為NF-κB通路激活的重要證據[19]。本研究選擇NF-κBp65作為牙齦癌檢測指標，旨在觀察NF-κBp65激活是否與局部微環境中RANKL/OPG比值增加有關，以及NF-κB信號通路是否是牙齦癌發生的重要信號通路，進而分析靶向RANKL治療牙齦癌時NF-κBp65表達變化與臨床效果和生存的關系。筆者臨床標本和體外培養細胞的研究結果同時提示，與正常對照組比較，牙齦癌中NF-κBp65存在過表達現象，提示局部微環境中RANKL/OPG比值增加可能導致NF-κB信號通路激活進而引起牙齦上皮細胞異常分化。

近年來雖然牙齦癌的基礎和臨床診療方法的研究取得很大進展，但治療效果未見顯著提高[20]。靶向治療是針對細胞受體、關鍵基因、調控分子等生物靶點進行干預，達到阻止腫瘤發生、發展并促進腫瘤細胞凋亡的特異性治療，因其發展迅速、療效較佳，引起眾多學者關注[21]。因此，明確牙齦癌發生過程中調控牙齦上皮細胞異常分化的分子信號機制對于牙齦癌有效治療靶點的選擇至關重要。本研究通過觀察RANKL、OPG、NF-κBp65蛋白表達及RANKL/OPG比值變化，初步探討牙齦癌細胞分化的可能調控機制，從而為尋找牙齦癌有效治療靶點提供幫助。