青稞堅(jiān)黑穗病LAMP 快速檢測(cè)技術(shù)的建立

楊 帆，胡章薇，姚 強(qiáng)

（青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院/青海省農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西寧作物有害生物科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，青海西寧810016）

青稞（Hordeum vulgare）為禾本科大麥屬，是大麥的一種特殊類型，又名裸大麥，因其具有較強(qiáng)的耐寒性，多分布在青藏高原高海拔的農(nóng)業(yè)區(qū)。種傳病害是影響青稞安全生產(chǎn)的重要因素之一，其中由大麥堅(jiān)黑粉菌（Ustilago hordei）引起的堅(jiān)黑穗病為害較為嚴(yán)重。大麥堅(jiān)黑粉菌的休眠菌絲體和冬孢子附著在種子表面，次年播種后分別以休眠菌絲體蔓延到芽鞘上，或冬孢子萌發(fā)形成侵染絲自幼苗胚芽鞘侵入為害[1]。受侵染植株田間顯癥前與健康植株無異，顯癥后再進(jìn)行防治意義不大。凌立等于1940 年調(diào)查發(fā)現(xiàn)，大麥堅(jiān)黑穗病的田間發(fā)病率一般在10%左右，最高可達(dá)60%[1]。利用內(nèi)吸性種子處理殺菌劑進(jìn)行播前種子處理可有效控制該病害[2]。雖然21 世紀(jì)堅(jiān)黑穗病的發(fā)生率、危害程度均遠(yuǎn)不及20 世紀(jì)，但現(xiàn)生產(chǎn)上每年仍有發(fā)生，若不采取有效措施，病原菌隨種子傳播侵染，病害發(fā)生則會(huì)逐年加重[3]。在生產(chǎn)上，僅為了防控該病害就進(jìn)行種子殺菌處理，具有一定的盲目性，同時(shí)造成一定的化學(xué)藥劑殘留和環(huán)境污染。因此，建立快速檢測(cè)技術(shù)至關(guān)重要。

本研究應(yīng)用的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是Notomi 等于2000年報(bào)道的一種能夠特異、高效、快速地?cái)U(kuò)增靶基因的新型核酸擴(kuò)增技術(shù)[4]。該技術(shù)在1 h 左右即可完成擴(kuò)增，其靈敏度是普通PCR 的100 倍[4]。結(jié)果可通過電泳儀[5]、real-time PCR 儀[5]及濁度儀[6]進(jìn)行檢測(cè)，還可通過SYBR Green Ⅰ[7]、鈣黃綠素[8]、羥基奈酚藍(lán)[9]染色后用肉眼識(shí)別。目前，這種分子檢測(cè)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于真菌[10]、細(xì)菌、病毒[11]等方面。鑒于LAMP檢測(cè)過程操作簡(jiǎn)單，反應(yīng)時(shí)間短，結(jié)果易于判斷，我們基于初步建立的黑穗病快速LAMP 檢測(cè)體系，通過優(yōu)化種子洗滌沉淀物總DNA 的提取方法[12]，以期建立完善的青稞堅(jiān)黑粉菌快速檢測(cè)技術(shù)體系，通過掌握種子的帶菌程度，進(jìn)行精準(zhǔn)施策，為青稞綠色生產(chǎn)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料、試劑與儀器

試驗(yàn)材料：青稞種子（北青1 號(hào)、北青2 號(hào)、北青3 號(hào)、北青6 號(hào)、北青8 號(hào)、昆侖14 號(hào)、昆侖15 號(hào)以及柴青1 號(hào)）及試驗(yàn)供試菌株大麥堅(jiān)黑粉菌（Ustilago hordei）、裸黑粉菌（Ustilago nuda）、禾生指葡孢霉（Dactylobotrys graminicola）、麥類核腔菌（Pyrenophora graminea）、大麥網(wǎng)斑菌（Pyrenophora teres）、禾谷鐮孢菌（Fusarium graminearum），均由青海省農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

試驗(yàn)試劑：Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR、dNTP Mixture、Loading Buffer，購自TaKaRa 公司；吐溫-20，購自索萊寶公司；Bst 2.0 WarmStart DNA Polymerase（10 Isothermal Amplification Buffer、MgSO4、Bst DNA 聚合酶），購自美國(guó)NEB 公司；氫氧化鈉，購自四川西隴科學(xué)有限公司。

主要儀器：DK-600A 電熱恒溫水槽，購自上海一恒科學(xué)儀器有限公司；TD5A 臺(tái)式低速離心機(jī)，購自湖南赫西儀器裝備有限公司；Centrifuge 5418R高速冷凍離心機(jī)，購自德國(guó)Eppendorf 公司；ABI 7500 實(shí)時(shí)熒光定量?jī)x，購自美國(guó)Applied Biosystems公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 人工模擬種子帶菌。取大麥堅(jiān)黑穗菌菌纓1粒（約150 mg）混于2 mL 水中，分別取其1/10、1/100、1/1 000 菌懸液混入1.800、1.980、1.998 mL 水中；裸黑粉菌取冬孢子粉150 mg；其他對(duì)照病原菌，在室內(nèi)培養(yǎng)基培養(yǎng)至滿皿后，加入無菌水制備菌懸液。最后將其分別倒入50 g 種子中，加200 mL 水、吐溫-20 1 mL，振蕩5 min，洗滌液3 000 r/min 離心10 min，去上清后備用。

1.2.2 裂解液快速提取DNA。1）將“1.2.1”節(jié)中制備的人工模擬樣品加入1 mL 濃度為3 mol/L 的NaOH溶液，65 ℃水浴30 min。取出離心管，加1 mol/L HCl中和，10 000 r/min 離心1 min，棄上清，加無菌水沖洗樣品，至pH 值為7～8。2）用牙簽分別挑取少量種子洗滌沉淀物，置于潔凈載玻片上摩擦，并不時(shí)在顯微鏡下觀察。待冬孢子破裂后取20 μL 裂解液于載玻片上與待測(cè)樣品混合，轉(zhuǎn)至離心管內(nèi)，裂解液補(bǔ)足至50 μL，80 ℃水浴裂解15 min，短暫離心后-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 RT-LAMP 檢測(cè)青稞種子中大麥堅(jiān)黑粉菌。以冬孢子粉添加量為1 粒、1/10 粒、1/100 粒、1/1 000粒和加有裸黑粉菌、禾生指葡孢霉、麥類核腔菌、大麥網(wǎng)斑菌以及禾谷鐮孢菌的種子洗滌沉淀樣品提取的DNA 為檢測(cè)樣本，以ddH2O 為陰性對(duì)照，進(jìn)行RT-LAMP 檢測(cè)，并在檢測(cè)結(jié)束加入SYBR GreenⅠ（10 000×）0.5 μL。供試引物為利用ITS（internal transcribed spacer）基因序列通過在線軟件Primer ExploreV5（http:// primerexplorer.jp/lampv5e/index.html）設(shè)計(jì)，詳見表1。引物合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。檢測(cè)體系為25 μL，各組分含量如表2 所示。65 ℃反應(yīng)1 h，每1 min 讀取熒光，反應(yīng)結(jié)束后加0.5 μL SYBR Green Ⅰ。根據(jù)實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增（曲線若為“S”型則為陽性，呈1 條直線則為陰性）和SYBR Green Ⅰ顯色法（顯示綠色為陽性，橙色則為陰性）為判定依據(jù)。

表1 LAMP 引物

表2 RT-LAMP 與可視化LAMP 檢測(cè)體系

（續(xù)表）

1.2.4 青稞堅(jiān)黑穗病LAMP 可視化檢測(cè)技術(shù)驗(yàn)證。隨機(jī)抽選實(shí)驗(yàn)室保存的8 個(gè)不同品種的青稞種子各50 g，加200 mL 水、吐溫-20 1 mL，振蕩5 min，洗滌液3 000 r/min 離心10 min，提取DNA，方法同“1.2.2”節(jié)。獲得種皮洗滌沉淀物的總基因組DNA后作為模板，ddH2O 為陰性對(duì)照，進(jìn)行LAMP 可視化檢測(cè)。檢測(cè)體系中各成分含量如表2，反應(yīng)前加SYBR GreenⅠ（10 000×）于PCR 管蓋內(nèi)，反應(yīng)結(jié)束后，瞬時(shí)離心觀察顯色情況，若為綠色則為陽性，橙色則為陰性。

2 結(jié)果與分析

2.1 冬孢子破裂

大麥堅(jiān)黑粉菌與裸黑粉菌成熟的單個(gè)黑粉菌冬孢子具有內(nèi)壁和外壁，外壁厚且堅(jiān)硬，嚴(yán)重阻礙冬孢子DNA 的提取。本研究參考并改進(jìn)了一年四季提取小麥矮腥黑穗菌冬孢子的方法[9]，用3 mol/L的NaOH 溶液水浴種子洗滌沉淀物，65 ℃、30 min后取適量在潔凈載玻片上來回摩擦，并不時(shí)放于顯微鏡下觀察，如圖1-B 時(shí)即可進(jìn)行DNA 提取。由于大麥堅(jiān)黑粉菌冬孢子為（5～9）μm×（6～7）μm，相比于直徑為5～9 μm 的裸黑粉菌冬孢子體積至少大1 倍，因此用載玻片來回摩擦十多下，可使大麥堅(jiān)黑粉菌冬孢子破裂，而裸黑粉菌冬孢子外壁卻不受影響。

圖1 破壁前（A）、后（B）的大麥堅(jiān)黑粉菌冬孢子

2.2 RT-LAMP 檢測(cè)青稞種子中大麥堅(jiān)黑粉菌

人工模擬種子帶菌樣品的實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增曲線（圖2-A）和SYBR Green Ⅰ顯色（圖2-B）結(jié)果均顯示，僅4 種不同冬孢子數(shù)量的種子洗滌沉淀樣品為陽性，其他為陰性。表明所建立的青稞堅(jiān)黑穗病快速檢測(cè)技術(shù)能夠特異性檢測(cè)出青稞的大麥堅(jiān)黑粉菌。

圖2 人工模擬種子帶菌檢測(cè)

2.3 青稞堅(jiān)黑穗快速檢測(cè)技術(shù)驗(yàn)證

分別以隨機(jī)選取的50 g 青稞不同品種（北青1號(hào)、北青2 號(hào)、北青3 號(hào)、北青6 號(hào)、北青8 號(hào)、昆侖14 號(hào)、昆侖15 號(hào)以及柴青1 號(hào)）種子的洗滌沉淀物總DNA 為模板，進(jìn)行LAMP 可視化檢測(cè)，結(jié)果如圖3 所示，北青3 號(hào)和昆侖15 號(hào)為綠色（陽性），其他為橙色（陰性），表明北青3 號(hào)和昆侖15 號(hào)2 個(gè)品種中攜帶大麥堅(jiān)黑粉菌，建立的快速檢測(cè)體系可用于青稞播前檢測(cè)大麥堅(jiān)黑粉菌。

圖3 青稞種子可視化LAMP 檢測(cè)

3 討論與結(jié)論

堅(jiān)黑穗病是青稞生產(chǎn)中最為常見、發(fā)病較為廣泛的種傳病害之一。田間顯癥后只能通過拔出病株來降低種子帶菌率，這種方式耗時(shí)耗力。種子處理殺菌劑的應(yīng)用可有效防治大麥堅(jiān)黑粉菌對(duì)青稞的侵染。但是帶菌種子與健康種子表觀沒有差異，導(dǎo)致在實(shí)際生產(chǎn)中出現(xiàn)藥物濫用的現(xiàn)象，給環(huán)境和糧食安全帶來巨大壓力。因此，建立種子播前的快速檢測(cè)技術(shù)對(duì)生產(chǎn)具有重要的指導(dǎo)意義。然而，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)大麥堅(jiān)黑粉菌的研究多集中于病原- 寄主互作[13]、分子變異和遺傳結(jié)構(gòu)分析[14]以及侵染機(jī)制等方面[15]，在快速檢測(cè)方面成果甚少。20 世紀(jì)對(duì)于此病害檢測(cè)方面的研究主要集中于傳統(tǒng)檢測(cè)，包括顯微鏡直接觀察法、種皮攜帶物洗滌離心后顯微觀察法以及冷凍吸水紙法等[16]。

本研究為建立完善的青稞堅(jiān)黑粉菌檢測(cè)技術(shù)，基于初步建立的LAMP 檢測(cè)體系，經(jīng)裂解液快速提取法提取種子表皮攜帶物的總DNA 后，進(jìn)行LAMP（環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)）檢測(cè)并驗(yàn)證。結(jié)果表明，裂解液快速提取法提取種皮洗滌沉淀物總基因組DNA，僅混有大麥堅(jiān)黑粉菌的種子洗滌沉淀物實(shí)時(shí)熒光和SYBR GreenⅠ可視化LAMP 檢測(cè)均為陽性，其他病原菌（大麥堅(jiān)黑粉菌、裸黑粉菌、禾生指葡孢霉、麥類核腔菌、大麥網(wǎng)斑菌、禾谷鐮孢菌）2 種檢測(cè)均為陰性。最后，通過對(duì)實(shí)際青稞種子進(jìn)行檢測(cè)，在8 個(gè)不同品種中檢測(cè)出北青3 號(hào)和昆侖15 種子攜帶有大麥堅(jiān)黑粉菌。

雖然目前僅有的大麥堅(jiān)黑粉菌與裸黑粉菌分子生物學(xué)信息均不能區(qū)分兩者，未能設(shè)計(jì)出特異性引物，但是本研究基于2 種黑粉菌在種子上帶菌方式和冬孢子的體積大小的不同，成功建立出可特異性檢測(cè)青稞種子中大麥堅(jiān)黑粉菌的技術(shù)體系。所建立的檢測(cè)技術(shù)可應(yīng)用于生產(chǎn)，為防治青稞堅(jiān)黑穗病提供科學(xué)的依據(jù)。