IKKα調控子宮內膜基質細胞cyclin D1的表達及其蛻膜化過程

楊殊琳 姚君寧 隋 聰 章漢旺 白 劍 饒 群

華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院(武漢，430000)

人類子宮內膜蛻膜化并不是由胚胎著床發動，但小鼠內膜蛻膜化必須依賴胚胎著床過程[1-2]。蛻膜細胞通過影響子宮內膜的容受性而影響胚胎著床和妊娠。臨床上很多疾病如著床失敗、反復流產、子宮內膜異位癥和子癇前期均與基質細胞蛻膜化異常相關[3-7]。目前證實核因子(NF)-κB轉錄因子家族在細胞生長中發揮重要作用。核因子kappa-B激酶抑制劑(IKK)α和β在多種應激條件下決定細胞的存活或凋亡。細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)在細胞從G1期進入S期過程中影響細胞周期進程[8]。對IKKα基因敲除細胞的研究顯示，IKKα可介導cyclin D1 Thr286的磷酸化，使cyclin D1從細胞核轉運至細胞質并被降解，從轉錄后途徑下調cyclin D1的表達[9]。IKKα缺乏將導致cyclin D1過表達從而參與多種癌癥的發生過程[10-11]。IKKα可從轉錄水平和轉錄后水平調控cyclin D1的表達，但是在子宮內膜基質細胞中對cyclin D1的調控方向并不清楚，對蛻膜化和胚胎著床的影響還需進一步研究。為了研究IKKα對cyclin D1的調控作用、對子宮內膜蛻膜化過程和容受性的影響，本研究以人和小鼠的子宮內膜基質細胞為對象，建立了體外和體內子宮內膜蛻膜化研究模型，從人和小鼠兩方面探討IKKα對cyclin D1的調控作用，以及在子宮內膜基質細胞的增殖、蛻膜化和胚胎著床過程中發揮的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1人原代細胞與細胞培養增生期子宮內膜均取材于2018年11月—2019年5月本院女性患者。納入標準：①年齡25～30歲；②因男方因素導致不孕；③月經周期規律；④輸卵管繼發不孕。滿足②/④+①+③即可納入。排除標準：①子宮內膜病變；②內分泌異常；③近3個月內服用激素。病理檢查結果均符合月經周期增生期時象改變。提取人子宮內膜基質細胞(hESCs)置于10%胎牛血清和1%青鏈霉素混合液的DMEM/F12培養基，在5%CO2、37℃孵育箱中培養。本研究經本院醫學倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

1.1.2實驗動物及飼養條件實驗動物操作程序均符合NIH實驗動物管理與使用指南。6周齡雌、雄SPF級昆明小鼠各15只，購自湖北省實驗動物研究中心，湖北省實驗動物質量合格證編號：42000600007146、42000600006595、42000600006807；實驗動物許可證編號：SYXK(鄂)2014-0049。小鼠體質量22～24 g，飼養于本院實驗動物中心SPF級動物房，室溫22～26℃，相對濕度50%～80%，每日給予12 h光照模擬晝夜變化，標準小鼠飼料自由進食和飲水，適應性喂養1周。本研究經本院實驗動物倫理委員會審批。

1.1.3藥物與試劑DMEM/F12培養基購自美國Hyclone公司；胎牛血清、胰蛋白酶、Opti-MEM、lipofectamine2000購自美國Life Technologies公司；無水乙醇、BCA蛋白濃度測定試劑盒、PBS粉劑、50×蛋白酶抑制劑Cocktail、蛋白上樣緩沖液、脫脂奶粉、青鏈霉素混合液、DEPC水、Tween-20、甘氨酸、氯化鈉、氯化鉀、濃鹽酸、Tris-base、SDS、甲醇、RNAse、碘化丙啶(PI)、ECL試劑盒、Western blotting配膠套裝、三氯甲烷、異丙醇、無水乙醇、RIPA裂解液均購于武漢谷歌生物科技有限公司；IV型膠原酶(LS004188)購于美國Worthington Biochemical Corporation；8-Br-cAMP 粉劑、MPA粉劑均購于美國 Sigma 公司; I型DNA酶(04536282001)購于美國Roche Applied Science公司；10-170KD蛋白Marker 購于美國Thermo Fisher公司；PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit、TRIZOL、SYBR Premix Ex TaqTM II(Tli RNaseH Plus)購于日本Takara公司；IKKα(CHUK)/NC siRNA購于中國廣州銳博銳博生物科技有限公司；β-actin兔抗小鼠/人多克隆抗體、HRP標記的羊抗兔二抗購于武漢谷歌生物科技有限公司；IGFBP1兔抗人多克隆抗體購于美國GeneTex公司；IKKα兔抗小鼠/人單克隆抗體、Cyclin D1兔抗小鼠/人單克隆抗體購于武漢博士德生物工程有限公司。

1.1.4體外轉染相關siRNA序列由中國廣州銳博銳博生物科技有限公司設計及合成。①IKKα(CHUK)siRNA 序列：正向 5’-UGUUCAUAGCCAUUUCUUC-3’；反向 5’-GAAGAAAUGGCUAUGAACA-3’。②siRNA NC序列：正向 5'-UUGUACUACACAAAAGUACUG-3'；反向 5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’。③siRNA NC-FAM序列：正向 5'-UUGUACUACACAAAAGUACUG-3'，修飾方式5'-FAM；反向 5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’, 修飾方式5'-FAM。

1.1.5體內轉染相關siRNA序列由中國廣州銳博銳博生物科技有限公司設計及合成。①IKKα(Chuk)siRNA 序列：Sense 5’-CAGCAACUCAAAGCUAAAUTT-3’；Anti-sense 5’-AUUUAGCUUUGAGUUGCUGTT-3’。②siRNA NC序列：Sense 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'；Anti-sense 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。③siRNA NC-FAM序列：Sense 5'-UUCUCCGAACGUGUUCACGUTT-3'；Anti-sense 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’,修飾方式5'-FAM。

1.1.6Real-time引物從NCBI查找核酸序列，用Primer Premier 5.0進行引物序列的設計，引物由武漢奧科生物技術有限公司合成，引物序列及預計擴增片段大小見表1。

表1 引物序列(5’-3’)

1.2 人子宮內膜基質細胞體外培養和蛻膜化模型建立

1.2.1hESCs原代分離培養傳代培養至第三代時接種至6孔板，3孔采用配置好的8-Br-cAMP溶液40 μl、MPA 溶液2 μl和蛻膜化培養基1.96 ml(2%FBS)繼續培養4 d誘導hESCs蛻膜化;另3孔使用蛻膜化培養基(2%FBS)培養基繼續培養作為對照組。顯微鏡下觀察蛻膜化干預第4日時細胞形態變化。Real-time PCR方法檢測蛻膜化細胞中PRL和IGFBP1 mRNA表達。用LightCycler 96分析。

1.2.2Westernblotting檢測PRL和IGFBP1蛋白表達恒定電流300mA轉膜1h，兔抗人/鼠β-actin 多克隆抗體稀釋比例為1:800，其余一抗稀釋比例均為1：1000，HRP標記的羊抗兔二抗稀釋比例為1：4000。用GENESys軟件進行圖片處理及分析。以 β-actin為內參，用Image J軟件進行灰度值測定，GraphPad行灰度值半定量分析。

1.2.3流式細胞分選技術檢測蛻膜化細胞周期變化①收集細胞離心；②用1 X PBS重懸洗滌細胞，離心棄上清(重復2次)；③用1.2ml 1 X PBS重懸細胞，加入2.8ml-20 ℃預冷的70%乙醇固定液，充分吹打混勻后-20 ℃過夜保存；④離心去上清，加入0.5 ml PBS重懸細胞(重復2次)。用0.1ml 1 X PBS細胞重懸；⑤向離心管中加入2.5μl RNAse(10ug/ml)置37℃恒溫搖床消化1h；⑥向離心管中加入50 μl PI(0.1mg/ml)，4℃避光靜置30min。根據細胞密度添加1 X PBS調整最終體積為400～500μl；⑦立即用流式細胞儀檢測細胞周期；⑧用LuxScan 軟件分析檢測結果。以上實驗重復3次。

1.2.4IKKα通過cyclinD1調控人子宮內膜基質細胞蛻膜化構建合成IKKα(CHUK)siRNA、陰性對照NC siRNA和FAM連接的NC siRNA，轉染至體外培養hESCs中(CHUK組和NC組各3孔)，8 h終止轉染并用8-Br-cAMP和MPA蛻膜化干預96 h，熒光顯微鏡下觀察轉染效率,顯微鏡下觀察細胞形態變化。Real-time PCR方法檢測IKKα、cyclin D1、PRL和IGFBP1 mRNA表達，Western blotting檢測IKKα、cyclin D1和IGFBP1蛋白表達，流式細胞分析儀分析細胞周期(方法同1.2.1)。比較轉染組和對照組細胞周期改變及cyclin D1、PRL和IGFBP1表達變化。以上實驗重復3次。

1.2.5小鼠子宮內膜蛻膜化模型建立性成熟雌性昆明鼠與輸精管結扎后的雄性昆明鼠合籠，見陰栓標記為D1(3只)。在第4日對一側宮角注射蓖麻油模擬胚胎著床誘導蛻膜化，對側宮角注射等量生理鹽水作為自身對照。D7處死小鼠，HE染色顯微鏡下觀察子宮內膜基質細胞的形態和內膜腺管，免疫組織化學觀察IGFBP1的表達，Real-time PCR和Western blotting檢測內膜細胞中IGFBP1、PRL的mRNA和蛋白表達(方法同1.2.1)。

1.2.6IKKα通過cyclinD1對小鼠子宮內膜蛻膜化過程及胚胎著床的影響性成熟雌性KM鼠與輸精管結扎后雄性KM鼠合籠，見陰栓(D1)宮角注射(3只)IKKα(Chuk)/NC siRNA,在第4日再次雙側宮角注射蓖麻油模擬胚胎著床誘導蛻膜化。于D7處死小鼠，HE染色顯微鏡下觀察子宮內膜基質細胞形態和子宮內膜腺管，免疫組織化學觀察IGFBP1表達，Real-time PCR和Western blotting分別檢測小鼠子宮內膜細胞中IKKα、cyclin D1、PRL和IGFBP1的表達。(方法同1.2.1)將性成熟雌性昆明鼠與正常雄性昆明鼠合籠，見陰栓(D1)宮角注射(3只)IKKα(Chuk)/NC siRNA,D6處死小鼠，記錄雙側子宮受精卵著床位點。

1.3 統計學處理

采用Graph Pad分析。組間比較應用獨立樣本秩和檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 8-Br-cAMP和MPA體外誘導hESCs蛻膜化

與對照組相比，8-Br-cAMP和MPA 蛻膜化組第4日hESCs形態由原本的長梭形變成多角形，細胞體積變大，細胞形狀變圓，細胞核變大顏色變淡，細胞界限變模糊(圖1A4，2247頁)；而對照組hESCs形態則維持長梭形未發生變化(圖1A2，2247頁)。Real-time PCR檢測第4日蛻膜化組細胞PRL mRNA水平(339.00±52.25 fold)高于對照組(1.00±0.07 fold)，IGFBP1(199.62±9.36 fold)高于對照組(1.00±0.29 fold)(均P<0.0001)。Western blotting檢測第4日蛻膜化組細胞IGFBP1的蛋白水平高于對照組(4.86±0.30 比1.23±0.16)(P<0.0001)(圖1B，2247頁)。體外蛻膜化過程中hESCs發生了G0-1到S期的阻滯，G0-1期細胞蛻膜化組(88.12±0.10)%比對照組(82.98±0.42)%(P=0.0003)，S期細胞蛻膜化組(1.36±0.13)%比對照組(7.36±1.12)%(P=0.00061)(圖1C，2247頁)。

2.2 下調IKKα后Cyclin D1過表達及hESCs體外蛻膜化

轉染NC siRNA-FAM組轉染效率見圖2A(2248頁)，hESCs形態由長梭形轉變為多角形，細胞體積變大變圓，細胞核變大顏色變淡，細胞界線變模糊(圖2B4，2248頁)；IKKα siRNA轉染的基質細胞形態未發生明顯變化(圖2B2，2248頁)。轉染IKKα(CHUK)siRNA組，Real-time PCR和Western blotting檢測到hESCs中cyclin D1的表達水平均提高，mRNA水平IKKα轉染組(11.00±0.13 fold)高于對照組(1.15±0.18 fold)(P<0.0001)；蛋白水平IKKα轉染組(3.69±0.22)高于對照組(2.26±0.23)(P=0.0112)，PRL、IGFBP1表達水平均低于對照組(PRL mRNA 1.00±0.33 fold比405.31±101.10 fold)(P=0.0161)，(IGFBP1 mRNA 1.00±0.33 fold比 637.81±194.00 fold)(P=0.0304)；IGFBP1 蛋白水平灰度IKKα轉染組0.96±0.11比2.62±0.15(P=0.0008)(圖2C，2248頁)。與轉染組相比，對照組S期細胞比例從(12.68±0.70)%下降至(2.87±0.03)%(P=0.0001)，G0-G1期細胞比例從(78.74±1.03)%升高至(86.74±0.47)%(P=0.0021)，發生了G0-1到S期的阻滯(圖2D，2248頁)。

2.3 假孕小鼠宮角注射蓖麻油誘導子宮內膜蛻膜化

小鼠子宮大體觀示，注射蓖麻油側宮角明顯增粗，如圖3A(2248頁)。HE染色可見注射蓖麻油側宮角子宮內膜明顯增厚，內膜基質細胞增大變圓且內膜腺體明顯增生擴張。免疫組化結果顯示，與注射生理鹽水側相比，注射蓖麻油側宮角內膜基質細胞和腺上皮細胞均高表達IGFBP1，如圖3B(2248頁)。Real-time PCR檢測到注射蓖麻油側PRL(338.99±52.25 flod)和IGFBP1(199.62±9.36 flod)表達高于對照側(1.00±0.07 fold, 0.99±0.30 fold)(P=0.0029、P<0.0001)；Western blotting檢測到注射蓖麻油側IGFBP1表達(灰度6.47±0.66)高于對照側(灰度1.90±0.26)(P=0.0030)(圖3C，2248頁)。

2.4 下調IKKα表達Cyclin D1過表達及小鼠子宮內膜蛻膜化和胚胎著床

在假孕小鼠子宮內膜蛻膜化模型的基礎上干擾IKKα的表達，并驗證轉染效果，不同激發波長下的轉染效率如圖4B(2249頁)。轉染側宮角和對照側宮角均增粗，內膜增厚(圖4A，2249頁)。HE染色顯示NC轉染側宮角腺管增生擴張，基質細胞核增大深染。IKKα轉染宮角基質細胞核大深染，未見增生擴張的腺管。免疫組織化學檢測IKKα轉染側宮角IGFBP1表達量低于對照側(圖4C，2249頁)。轉染側IKKα(CHUK)、PRL和IGFBP1表達低于對照側(IKKα1.33±0.31 fold比8.10±1.18 fold，P=0.0052,灰度IKKα0.41±0.29比2.32±0.15，P=0.004；PRL 1.00±0.33 fold比471.97±54.89 fold，P=0.0010；IGFBP1 0.99±0.33 fold比671.14±74.00 fold，P=0.0008，灰度0.98±0.40比6.33±0.76，P=0.0033)，cyclin D1表達高于對照側(10.00±0.59 fold 比2.49±0.21 fold，P=0.0003，灰度2.64±0.67 比 0.97±0.29，P=0.0427)(圖4D，2249頁)。真孕小鼠IKKα轉染側胚胎著床數少于NC轉染側(5.33±0.49比9.67±0.33，P<0.0001)(圖4E，2249頁)。

3 討論

蛻膜化是子宮內膜獲得容受性的必要過程。當胚胎著床發生時，蛻膜化的基質細胞包繞胚胎與之建立起直接聯系，并產生一系列細胞因子活化血管內皮細胞、免疫細胞和上皮細胞，在胚胎的識別和選擇中發揮作用。子宮內膜蛻膜化過程伴隨著細胞周期改變，cyclin D1作為G0-G1期關鍵蛋白，在細胞周期的調控中發揮了重要作用[12-13]。研究顯示，IKKα在哺乳動物上皮細胞中可通過RANK/RANKL介導的NF-κB活化促進細胞周期蛋白D表達[9]。IKKα基因敲除小鼠表皮細胞的失控增殖也提示了IKKα在細胞增殖中作用[14-15]。提示IKKα與細胞周期的關系。Cyclin D1在細胞中分布具有細胞周期特異性。新合成的cyclin D1與CDK4/6結合被轉運至細胞核介導pRb磷酸化。在細胞周期的S期，cyclin D1僅存在于細胞質內[16]。研究顯示，在IKKα-/-細胞中，cyclin D1穩定存在于細胞核中，當回補IKKα時，cyclin D1的這種分布特性消失。研究證實IKKα可通過 T細胞因子(Tcf)轉錄因子介導cyclin D1 Thr286的磷酸化[17]。因此，IKKα可介導cyclin D1 Thr286的磷酸化，使其從細胞核轉運至細胞質并降解，從而從轉錄后途徑下調了cyclin D1的表達[18]。

為研究IKKα介導的cyclin D1下調是否在蛻膜化過程中具有調控作用，本研究以hESCs體外培養為基礎，給予8-Br-cAMP和MPA干預誘導體外蛻膜化過程。結果顯示，在體外hESCs蛻膜化干預4 d時細胞形態變為明顯的蛻膜化細胞狀態，IGFBP1和PRL水平升高，hESCs細胞發生G0-G1到S期的阻滯。為明確IKKα對cyclin D1表達的調控在hESCs蛻膜化過程中的影響，本研究構建了IKKα的siRNA，通過體外轉染子宮內膜基質細胞，并給予8-Br-cAMP和MPA誘導蛻膜化。檢測干擾IKKα RNA后蛻膜化干預96h時cyclin D1、IGFBP1和PRL的表達，結果顯示下調IKKα時，cyclin D1表達顯著上調，IKKα siRNA轉染組IGFBP1和PRL表達水平低于NC siRNA轉染組。細胞周期結果顯示IKKα siRNA轉染組細胞周期未發生明顯變化，而NC siRNA轉染組細胞周期發生了G0-G1到S期阻滯。以上結果提示，下調IKKα通過過表達cyclin D1促進hESCs增殖抑制其分化，導致其無法發生蛻膜化。

在動物試驗中，本研究利用蓖麻油宮角注射技術成功建立體內蛻膜化模型，結果發現注射蓖麻油側宮角明顯增粗，內膜增厚，形態學觀察見子宮內膜大量腺管增生擴張，基質細胞核大深染，發生蛻膜化樣變化。腺上皮細胞和基質細胞廣泛高表達IGFBP1，GFBP1和PRL表達高于對照側。說明本研究建立的小鼠體內蛻膜化模型是成功的。為進一步研究IKKα對cyclin D1表達的調控在體內蛻膜化過程中的影響，我們利用IKKα siRNA轉染一側宮角并雙側宮角注射蓖麻油誘導蛻膜化過程，結果顯示雙側宮角均增粗，內膜增厚，HE染色顯示IKKα siRNA轉染側基質細胞增生核變大深染，但未見增生擴張的腺體，IGFBP1表達量未升高。NC siRNA轉染側腺體明顯增生擴張，基質細胞核增大變圓深染發生蛻膜化樣改變，IGFBP1表達量升高，廣泛表達于內膜基質細胞和腺上皮細胞。與NC siRNA轉染側相比，IKKα轉染側內膜中cyclin D1表達水平上調，IGFBP1和PRL表達水平低于NC轉染側。蛋白表達水平與RNA表達水平趨勢一致。IKKα siRNA轉染側胚胎著床數少于NC siRNA轉染側。提示NC轉染側宮角蛻膜化成功，IKKα轉染側宮角基質細胞發生了蛻膜化(因活體是復雜的網絡，單一的干預因素造成的改變可被其他途徑代償)但是內膜腺體和血管均未完成蛻膜化過程，IGFBP1和PRL等蛻膜化相關因子分泌低于對照組。子宮內膜這種不完全的蛻膜化改變最終影響了胚胎著床。故認為，干擾IKKα的表達使cyclin D1過表達，可影響小鼠子宮內膜蛻膜化過程中腺體改變，最終造成蛻膜化過程不完全，從而影響胚胎著床。

綜上所述，本研究建立了體外和體內子宮內膜蛻膜化研究模型，從人和小鼠兩方面進行論證，探討了IKKα對cyclin D1的調控作用對子宮內膜蛻膜化過程和胚胎著床的影響。下調IKKα的表達導致cyclin D1過表達，可以抑制子宮內膜蛻膜化并影響胚胎著床。該結論有望揭示部分反復著床失敗和早期流產患者的病理生理機制，為輔助生殖技術提供新的治療靶點。