HIF-1α抑制劑在白血病治療中的研究進展

張月仙,陳 亨,沈云峰

0 引言

骨髓微環境為低氧狀態,低氧是影響造血干細胞和白血病細胞生物學的關鍵微環境因素。1992年Wang等[1]在研究缺氧誘導的紅細胞生成素(Erythropoietin,EPO)的基因表達時，發現一種蛋白質,能與EPO基因3′端增強子的寡核苷酸序列特異性結合,并促進EPO的轉錄,首次將這種蛋白質命名為缺氧誘導因子-1(HIF-1)。

HIF-1主要由HIF-1α和HIF-1β 2個亞基組成。HIF-1α是唯一的氧氣調節亞單位,可通過刺激葡萄糖轉運蛋白、糖酵解酶和糖酵解誘導因子的表達,調節從氧化應激反應到糖酵解的代謝[2]。HIF-1α在正常組織和癌細胞中都是缺氧反應的重要調節因子,低氧時可與HIF-1β結合,調控多種低氧反應性基因的轉錄與表達。HIF-1α在肝癌、肺癌、骨肉瘤、膠質瘤、卵巢癌、腎細胞癌等多種腫瘤組織中過度表達,并調節其生物學行為,包括新生血管生成、腫瘤細胞的新陳代謝、腫瘤干細胞的免疫逃逸等。而在白血病微環境中,各種異常均表明存在HIF-1反應,如VEGF、CXCL12、SCF的分泌增加,以及缺氧程度和酸度的增加。Bonnet、Rouault-Pierre等[3-4]研究證實,急性淋巴細胞白血病(ALL)患者的骨髓在白血病晚期階段高度缺氧,且所有患者確診時均有HIF-1α過表達,當達到細胞遺傳學緩解時,HIF-1α染色陽性率顯著降低。此外,Wang等[5]為了探討HIF-1α和VEGF-A基因在AML中的作用,收集了57例AML患者和17例正常人外周血和骨髓標本,結果顯示,急性髓系白血病(AML)患者HIF-1α和VEGF-A的表達均高于正常對照組,且HIF-1α與VEGF-A呈正相關,認為這與白血病細胞的生長有關,可能成為一個很有前途的治療靶點。Kontos等[6]發現,HIF-1α mRNA高表達的慢性淋巴細胞白血病(CLL)患者的總體生存率較低,其表達狀態指導預后的意義可獨立于臨床分期和其他預后指標,因此,HIF-1α過表達可作為CLL預后不良的獨立分子標志物。Abdul-Aziz等[7]發現,缺氧可導致骨髓中AML細胞的轉移抑制因子(Migration inhibitory factor,MIF)高表達,且表達水平高于外周血或脾臟。結果表明,在缺氧條件下,沉默HIF-1α可抑制MIF的轉錄調控,從而提高AML模型的存活率,表明缺氧/HIF-1α/MIF軸在促進AML腫瘤存活和增殖方面的重要作用。

近期研究表明,HIF-1通路的激活在白血病的進展、治療和預后中發揮著重要作用。因此,抑制HIF-1α的表達成為延緩疾病進展、治療白血病的新思路。目前,針對HIF-1α抑制劑的研究,多集中于實體瘤領域,而白血病方面較為少見。本文總結了近年來在白血病領域研究較多的幾種HIF-1α抑制劑及其在白血病中的研究進展。

1 HIF-1的功能結構及基因調控

1.1 HIF-1的結構 HIF-1以異源二聚體的形式存在,主要由HIF-1α和HIF-1β 2個亞基組成。HIF-1α為HIF-1特有,是活性亞基,決定了HIF-1的穩定性和活性;HIF-1β是組成性亞基,又稱為芳烴受體核轉位蛋白(Aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator,ARNT)。HIF-1α和HIF-1β亞基均為bHLH/PAS家族的成員,包含bHLH結構域(Basic helix-loop-helix,bHLH)、PAS結構域(Per-ARNT-Sim,PAS)、反式轉錄激活結構域(Transcriptional activation domain,TAD)、氧依賴性降解結構域(Oxygen-dependent degradation domain,ODD區)等結構。

1.2 HIF-1的降解和穩定性 常氧條件下,在細胞漿內,氧感受器輔氨酰羥化酶(Prolyl hydroxylases,PHDs)羥化HIF-1α亞基ODD區輔氨酸,使HIF-1α與VHL蛋白(Von hippel-lindau protein,pVHL)結合形成復合物。pVHL是泛素連接酶的成分之一,可引導HIF-1α進入泛素-蛋白酶體途徑降解。而在缺氧條件下,由于氧分子減少,PHDs的作用受到抑制,阻止了HIF-1α的泛素降解途徑,導致HIF-1α降解速度減慢,引起HIF-1α在細胞核內積聚并轉錄激活。HIF-1α的轉錄激活過程相對復雜,此過程的調控因子包括:P300/CBP、CITED2、MAPK、HSP90、SRC家族等,這些因子相互作用,協同調節HIF-1。

1.3 HIF-1對下游靶基因的調控 HIF-1α轉錄激活以后在細胞核內聚集,并與核內的HIF-1β結合形成有活性的HIF-1復合物,與其調節的下游靶基因的缺氧反應元件(Hypoxia response element,HRE)結合,形成轉錄起始復合物啟動靶基因的轉錄。HRE是HIF-1靶基因的啟動子或增強子內所共有的一段基因序列,又稱反式作用DNA序列,為HIF-1α的DNA結合位點。目前,已有超過70個基因被HIF-1調控,這些下游靶基因被激活后,可促進腫瘤血管生成、細胞增殖,保證腫瘤的能量代謝,最終加速腫瘤轉移和耐藥性的出現。

2 HIF-1α抑制劑

2.1 棘霉素 棘霉素(Echinomycin)是喹噁啉家族的一員,通過2個扁平狀的喹喔啉環插入到DNA分子的堿基對之間,從而抑制了DNA的復制、轉錄和RNA合成[8]。臨床前研究證實,棘霉素在肝癌、黑色素瘤、乳腺癌、結腸癌、惡性肉瘤等疾病中具有抗腫瘤活性。棘霉素的靶序列包括缺氧反應元件序列,從而使棘霉素成為有效的HIF-1α抑制劑。

2.2 BAY 87-2243 BAY 87-2243是選擇性HIF-1α抑制劑,主要是通過抑制線粒體復合體I來抑制線粒體活性氧簇(Reactive oxygen species,ROS)的產生,進而降低HIF-1活性。BAY 87-2243的活性依賴于PHDs和VHL蛋白,因此，PHDs-VHL-蛋白酶體軸在HIF-1α蛋白降解中具有重要作用。

2.3 EZN-2208 伊立替康是拓撲異構酶I抑制劑,SN-38是伊立替康的活性代謝物,其溶解性差,不適合作為治療劑,研究者將聚乙二醇附著在SN-38上開發出了EZN-2208。與伊立替康相比,EZN-2208的半衰期更長,溶解性更好,藥代動力學更優,不良反應更少[9]。目前,EZN-2208在晚期成人實體瘤、兒童復發性或難治性實體腫瘤中具有臨床耐受性,主要的不良反應包括腹瀉、脫水、骨髓抑制、發熱性中性粒細胞減少、惡心和疲勞等[10-11]。EZN-2208還可誘導下調腫瘤中的HIF-1α及其下游靶基因(如MMP2、VEGF、GLUT1、GLUT3等)的mRNA水平,具有更強的抗增殖、抗凋亡和抗血管生成作用。

2.4 吖啶黃素 吖啶黃素(Acriflavine,ACF)是一種FDA批準的具有HIF-1α抑制特性的小分子天然化合物,可抑制上皮細胞向間充質轉化,激活p53導致細胞死亡,并誘導線粒體或內質網凋亡和自噬。ACF可抑制乳腺癌、骨肉瘤、肝細胞癌、結直腸癌和腦腫瘤等多種腫瘤的生長和進展。臨床研究顯示,長期服用ACF作為抗腫瘤藥物，未發現重大不良反應[12-14]。

2.5 雷公藤甲素 雷公藤甲素(Triptolide,TPL)是從雷公藤中提取的一種環氧二萜內酯化合物,具有抗炎及免疫抑制作用,主要用于自身免疫性疾病,如類風濕性關節炎、腎病綜合征、潰瘍性結腸炎等。TPL可抑制腫瘤細胞的生長,包括急性髓系白血病、乳腺癌、骨肉瘤、卵巢癌、肺癌、前列腺癌、神經母細胞瘤和多種消化道腫瘤(如結腸癌、肝癌、胃癌和胰腺癌)等。

2.6 2-甲氧基雌二醇 2-甲氧基雌二醇(2-methoxyestradiol,2-ME2)是一種天然存在的雌激素代謝物,作為一種抗癌劑已被廣泛研究,在體內外對尤文肉瘤、軟骨肉瘤、骨肉瘤、食管癌、肝細胞癌、卵巢癌、鼻咽癌、前列腺癌等腫瘤均有抑制生長和誘導凋亡的作用。2-ME2也具有抗白血病活性,其主要靶點為缺氧誘導因子,可抑制HIF-1α、微管和腫瘤血管生成,可能的作用機制包括細胞在G2/M期的聚集,抑制超氧化物歧化酶(SOD)和活性氧的積累,增加p53和p21的表達,以及細胞色素的線粒體釋放等[15]。2-ME2是一種耐受性良好的小分子藥物,口服具有活性,優于其他化療藥物。

3 HIF-1α及其抑制劑在白血病方面的研究進展

3.1 CLL CLL是西方國家最常見的成人白血病,其特征是大量成熟的克隆性B淋巴細胞在外周血、骨髓、脾臟等中積聚。在CLL中,HIF-1α促進骨髓的新生血管生成,調節趨化因子受體和細胞黏附分子的表達,包括關鍵的歸巢和遷移因子(如CXCR 4、CXCL 12等),從而維持CLL細胞在骨髓微環境內的存活[16]。

TP53異常的CLL患者對以氟達拉濱為基礎的化療方案具有固有的抵抗力。針對此問題,Griggio等[17]研究了BAY 87-22433在TP53異常的CLL細胞中的作用，結果顯示,與TP53野生型細胞相比,TP53異常的CLL細胞HIF-1α的表達水平顯著升高，轉錄活性更強,且BAY87-22433克服了TP53基因缺失的白血病細胞對氟達拉濱的耐藥問題,與伊魯替尼聯合應用具有很強的協同細胞毒作用,還可顯著減少骨髓中白血病細胞的浸潤,增加白血病細胞凋亡的比例。這些證據表明,HIF-1α抑制劑可作為一種有前途的CLL治療策略。

Valsecchi等[16-18]用EZN-2208治療CLL,發現EZN-2208可明顯抑制HIF-1α的表達,從而損害CLL細胞中CXCL 12因子的定向趨化作用,減少CLL細胞對基質的黏附和在脾臟及骨髓中的定植,并可誘導細胞死亡,延長小鼠存活時間。Valsecchi等[19]還發現,EZN-2208可增強CLL細胞對氟達拉濱誘導CLL細胞凋亡的敏感性,顯示出明顯的抗白血病活性。

3.2 慢性髓系白血病(CML) CML是一種以bcr-abl融合蛋白的存在為特征的骨髓增生性腫瘤。bcr-abl融合蛋白是一種活性酪氨酸激酶,可促進CML細胞的復制和存活,而HIF-1α在CML干細胞的存活和維持中起重要作用。Zhang等[20]研究HIF-1α在CML的發生和維持中的作用時發現,由于HIF-1α的缺乏,導致了白血病干細胞(Leukemia stem cells,LSC)中細胞周期抑制因子p16InK4a、p19Arf、p57以及凋亡基因p53的表達增加,因此,抑制HIF-1α通路可能有效根除白血病干細胞,為開發HIF-1α抑制劑治療CML提供理論基礎。

Cheloni等[21]的小鼠CML模型實驗表明,ACF能減少白血病的發生及LSC維持,在體內外對非CML造血細胞的影響較小。ACF還可減輕小鼠的整體CML負擔,表現為脾腫大程度減輕,骨髓、外周血和肺中的白血病細胞減少。因此,ACF成為抑制LSC、防止CML復發的一種可能治療策略。Ng等[22]通過沉默HIF-1α基因,證明CML干細胞在缺氧條件下的維持是依賴HIF-1α的。CML細胞中的一些缺氧調節基因,尤其是廣泛參與生存和細胞黏附的基因,也可能是CML干細胞的治療靶點。因此,聯合抗BCR-ABL1和抗HIF-1α治療，在消除LSC和治愈CML方面前景廣闊。

Chen等[23]探討TPL在耐藥髓系白血病細胞系中的作用時提到,TPL通過下調HIF-1α和Nrf2的表達,分別提高了耐藥細胞株HL60和K562對阿霉素及伊馬替尼的藥物敏感性,提示TPL對上述2種耐藥細胞株均具有高度毒性,且呈劑量依賴關系。當TPL聯合這2種抗癌藥物時,HIF-1α在mRNA和蛋白水平均下調,下游基因如BNIP3、VEGF和CAIX在mRNA水平下調,CXCR4在蛋白水平下調,提示TPL可明顯影響HIF-1α及其下游靶基因的功能和表達。

此外,姜黃素作為一種印度香料,可通過阻止細胞轉化、增殖和侵襲以及誘導細胞凋亡來發揮抗腫瘤作用。Monteleone等[24]采用SWATH-MS技術評價了亞毒性劑量姜黃素對K562細胞的作用。結果顯示,姜黃素可誘導糖代謝相關蛋白持續減少,其中大部分是HIF-1α靶點,其影響代謝酶譜的機制與miR-22介導的IPO7表達下調導致HIF-1α活性降低有關。結果表明,miR-22/IPO7/HIF-1α軸可能是姜黃素的一個新的分子靶點,為更好地定義姜黃素的治療活性和抗癌特性提供了新的見解。

3.3 ALL 在急性T淋巴細胞白血病中,HIF-1α促進Notch1信號激活,導致細胞增殖、侵襲和耐藥。有關急性B淋巴細胞白血病中HIF-1因子作用的數據較少,目前已經證實的是HIF-1α由骨髓中的白血病B細胞表達[25]。

治療急性T淋巴細胞白血病的化療方法可有效減少腫瘤負荷,然而,由于白血病前干細胞的存在,使得疾病容易復發;由于其獨特的低增殖狀態,白血病前干細胞對現有化療藥物的敏感性較低。Gerby等[26]為鑒定靶向白血病前干細胞的化合物,通過高通量篩選的方法篩選出2-ME2,證實2-ME2可通過抑制Notch1下游效應分子MYC的翻譯,阻止SCL/TAL1活性,從而消除白血病前干細胞的自我更新活性,但不影響MYC在正常的造血干祖細胞中的功能。此外,Zhang等[15]研究2-ME2在急性T淋巴細胞白血病的作用機制時發現,2-ME2可導致G2/M期細胞周期阻滯,引起急性T淋巴細胞白血病細胞出現典型的凋亡改變,還可通過上調p21蛋白、下調Bcl-2蛋白和下調功能失調的p53蛋白來誘導細胞凋亡。

3.4 AML AML是一種高度異質性疾病,由多種染色體畸變和調節髓系細胞分化及增殖的基因突變引起。Wang等[27]研究棘霉素在TP53突變的AML中的作用時發現,HIF-1α在突變的AML細胞中表達水平更高,與傳統的化療藥物和放射療法相比,棘霉素可選擇性地消除CD34+CD38-AML腫瘤干細胞,對白血病和淋巴瘤具有顯著的治療效果。此外,在人AML異種模型中,采用棘霉素短期治療可預防AML的連續移植。上述結果支持棘霉素優先針對AML干細胞的觀點。

Zhe等[28]研究了2-ME2對于AML的生物活性,結果顯示,在AML中,HIF-1α的表達隨著2-ME2劑量的增加而降低,且VEGF、GLUT1和HO-1的表達也在轉錄水平受到抑制。此外,在相同濃度下,AML細胞對2-ME2的敏感性高于阿糖胞苷,而2-ME2對正常造血干細胞的作用弱于傳統的化療藥物。

當前,維甲酸-三氧化二砷(ATRA-ATO)聯合治療是治療急性早幼粒細胞白血病(Acute promyelocytic leukemia,APL)的標準方案,治愈率較高,但目前出現了對砷劑的抗藥性,而且攜帶PLZF-RARA融合蛋白的APL患者對維甲酸治療存在部分抗藥性。有報道,在APL中,沉默HIF-1α可延緩白血病進展,并與全反式維甲酸協同消除白血病干細胞[29]。因此,Coltella等[30]對EZN-2208進行研究,發現EZN-2208處理APL細胞后,HIF-1α靶基因的表達呈劑量依賴性下調,這些基因參與了關鍵的促癌功能,如癌癥代謝、細胞遷移等,可抑制APL小鼠模型中白血病的進展,延長小鼠的存活時間。與ATRA聯合使用時,EZN-2208在清除白血病和根除白血病干細胞方面具有協同作用。

4 總結

HIF-1α可以作為判斷白血病預后的獨立危險因素,也可作為抗白血病的重要靶點。目前,大多數缺氧誘導因子抑制劑已經在實體瘤中進行了研究,少量用于惡性血液病的臨床前模型測試。雖然HIF-1α抑制劑在白血病中的研究處于早期階段,但綜合現有文獻中關于缺氧誘導因子在白血病中作用和功能的分析,隨著研究的逐步深入,HIF-1α抑制劑有望能為目前無法治愈或為一線治療成功后復發的患者提供一個可靠的治療選擇。