基于整合藥理學的當歸抗動脈粥樣硬化的作用機制研究

方歡樂,張 慧,陶炎炎,李瑤窈,陳衍斌

0 引言

動脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)是心血管疾病發生的基礎,其可導致冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、缺血性腦卒中等阻塞性血管疾病，威脅著人類健康。我國中醫將AS的發病機制歸結為氣、血、津液紊亂,臟腑功能失調而形成痰證、瘀證等[1]。當歸為傘形科植物當歸[Angelica sinensis(Oliv.)Diels]的干燥根,具有補血活血作用[2]。現有研究表明，當歸活血化瘀作用可對血液系統產生抗動脈粥樣硬化作用[3],但其作用機制及物質基礎尚不明確。

中藥整合藥理學平臺整合中藥材數據、中藥方劑數據、中藥成分數據、中藥靶標數據、疾病相關分子數據資源,采用人工智能、數據挖掘、網絡計算及可視化等方法和技術,開展中藥(含方劑)靶標預測及功能分析、 證候相關分子挖掘及功能分析等模塊,可建立的“中藥-成分-靶標-疾病”多維分析平臺,從分子水平揭示中藥藥效物質與疾病作用關系,其研究路線見圖1。本研究采用TCMIP V2.0(http://www.tcmip.cn),探究當歸治療動脈粥樣硬化的活性成分及其可能的分子作用機制。

圖1 網絡藥理學研究路線圖

1 資料與方法

1.1 當歸化學成分的篩選 在 TCMIP V2.0 的“中藥材數據庫”中,可得到關于當歸藥材的化學成分以及相關化學成分對應的靶標。

1.2 候選靶標來源及其靶標預測 在功能列表中藥(含方劑)靶標預測及功能分析界面中,在疾病檢索項下勾選“atherosclerosis” 構建其疾病靶標數據庫。根據成藥性等級,選擇目標當歸的化學成分庫，依據成藥性評價等級,根據成藥性的優劣,選擇相似性分數≥0.8的成分為當歸候選靶標。對候選靶標進行基因功能挖掘,進一步開展富集分析。

1.3 蛋白質-蛋白質相互作用信息 通過 TCMIP的中醫藥關聯網絡挖掘資源提供的蛋白質-蛋白質相互作用(Protein-protein interaction,PPI)的數據庫HAPPI、Reactome等，獲得當歸作用靶標與AS 疾病靶標之間的PPI信息。

1.4 網絡構建及分析 選取中藥-疾病相互作用網絡的核心節點;通過計算網絡節點的連接度(Degree)、介度(Betweenness)和緊密度(Closeness),篩選網絡中的核心節點基因,構建“當歸-動脈粥樣硬化”相互作用網絡,并通過網絡拓撲特征計算及基因功能和通路的富集分析,構建“當歸-化學成分-核心靶標-關鍵通路-疾病”的多層次關聯網絡,發現當歸干預動脈粥樣硬化疾病的物質基礎及其作用機制。

1.5 基因功能和通路富集分析 通過 TCMIP的中醫藥關聯網絡挖掘資源如GO(Gene ontology)、KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)等數據庫,對關鍵靶標的基因和通路富集分析(選擇),P<0.05篩選差異有統計學意義的生物功能及過程,選取P值前20的關鍵通路信息。

2 結果

2.1 當歸化學成分靶標預測及分析 通過TCMIP V2.0平臺對當歸化學成分的分析結果可知:共收集了當歸64個化學成分，主要含有揮發油、有機酸、香豆素類、生物堿類、氨基酸、萜類等,預測當歸的潛在靶標數量為677個。對當歸潛在靶標進行基因功能分析和通路富集分析。選擇P值前20的主要基因功能信息列于表1，即為當歸候選靶標基因所參與的生物學功能信息,結果發現其功能多與細胞膜離子通道、GABA-A受體、電壓門控鈉離子通道、鈉、氯離子通道、核受體、類固醇激素受體、氨基酸類神經遞質(NMDA受體)、氧化還原酶活性等相關。同時對當歸潛在藥靶進行通路分析,所得分析結果中,選擇P值前20的關鍵通路信息列于表2中,即為當歸候選靶標參與通路的信息分析表,發現主要在神經遞質的調節、核受體轉錄、碳水化合物代謝、能量代謝、脂類代謝、RNA生物合成、維甲酸循環病、RORA(維甲酸孤核受體A)基因的表達、PPARA基因的表達等涉及多個系統的疾病。現有實驗研究顯示，當歸可產生保護心血管、鎮痛、抗炎、抗氧化、平喘、調節平滑肌、抗腫瘤等作用[4],其對造血系統、循環系統、神經系統、免疫系統等多個系統產生的作用與當歸候選靶標參與通路信息分析是一致的。

表1 當歸候選靶標的功能信息

表2 當歸候選靶標參與通路的信息

2.2 當歸治療動脈粥樣硬化的核心靶標網絡、基因功能和通路富集分析

2.2.1 核心靶標網絡 通過整合分析的網絡分析模塊,基于PPI數據,構建當歸潛在靶標與疾病靶標相互作用網絡,見圖2。圖中共得到56個與AS及藥物相關核心網絡靶標。其中藥物作用直接靶標23個,疾病直接靶標30個,疾病與藥物間共有靶標3個。表1列舉了degree排名前20的靶標，以疾病直接靶標為主的包括:ESR1、SCARB1、NR1H4、CEPT、PPARG、APOE、LCAT等。

藥物作用靶點的主要來源是疾病靶點,由圖2可知,當歸與AS共有的3個靶標分別為PPARG 、MTTP、 PLA2G2A。其中PPARG是共有靶點,同時是網絡中相互作用較高的靶點。PPARG主要負責脂類的分解代謝等,參與體內包括脂肪細胞的分化、炎癥反應、動脈粥樣硬化等病理生理過程。而AS的發病主要為脂質浸潤、炎性反應。所以預測當歸抗AS的靶點可能為PPARG。有報道，當歸芍藥散具有抗AS作用,其機制可能與促進其主動脈斑塊內PPARG表達有關[5]。

圖2 當歸“藥物作用靶標-動脈粥樣硬化”相互作用網絡

2.2.2 基因功能分析 通過GO和KEGG數據庫的基因和功能分析,結果見表4、表5。當歸的藥物靶標和AS疾病靶標基因功能分析結果顯示，當歸通過參與核受體活性、類固醇激素受體、抑制及激活細胞外配體門控離子通道、GABA氯離子通道活性、結合膽固醇、膽汁、參與調節突觸后膜氯離子電位、核受體轉錄輔酶活性、膽汁通道活性、與轉錄因子的結合、激活膽固醇通道、結合類固醇等多個相關條目改善AS。在通路富集中顯示，當歸對抗AS的可能通路有核受體轉錄途徑、細胞類泛素化、高密度脂蛋白重塑、膽汁酸、膽汁鹽的代謝,調節過氧化物酶體增殖活化受體α(PPARα)活性基因的表達及類固醇、乳糜微粒、白色脂肪細胞的含量,參與炎癥因子信號通路及雌激素依賴基因的表達等。而現有實驗研究表明，高密度脂蛋白(HDL)具有抗動脈粥樣硬化作用。目前已經有人提出抑制膽固醇脂轉運蛋白作為提高HDL水平的一種方法[6]。炎癥因子也參與動脈粥樣硬化炎癥反應[7]。而PPARα作為核受體超家族的一員,可通過調節炎性細胞因子及表面黏附分子的表達等對抗動脈粥樣硬化[8]。

表5 當歸治療動脈粥樣硬化核心靶標通路富集分析

2.2.3 當歸治療動脈粥樣硬化的“中藥-成分-靶標-通路”多維網絡分析 基于圖2,采用網絡拓撲特征計算與核心靶標基因功能及核心靶標通路的富集分析,建立當歸治療動脈粥樣硬化的“中藥-成分-靶標-通路”多維網絡結果圖,見圖3。進一步分析當歸干預動脈粥樣硬化疾病的物質基礎及其作用機制。

由圖3可知,當歸的核心靶標有26個,當歸藥材64種成分,其中17種有效成分直接或間接作用AS,直接作用的8種成分主要為有機酸類和揮發油類。軟脂酸通過調節PPARα、CCL2、MMP9作用于IL-4及IL-13信號通路，對抗動脈粥樣硬化性疾病。藁本內酯、東莨菪堿內酯通過MTTP、APOE作用干擾乳糜微粒作用,調節脂質代謝,對抗AS。

現有研究報道,血脂異常升高是動脈硬化引起心腦血管疾病的主要因素之一,當歸揮發油具有一定的降脂及抗動脈粥樣硬化作用[9],炎癥反應是動脈硬化引起心腦血管疾病的主要因素之一[10],當歸有機酸可通過降低炎癥因子的表達,抑制炎癥反應和脂質介導的動脈粥樣硬化[11]。實驗研究和網絡研究結果一致。

圖3 當歸治療動脈粥樣硬化的“核心成分-關鍵靶標-主要通路”多維網絡關系

3 結論

AS的發病過程主要表現在動脈血管中膽固醇的大量積累和慢性炎癥的產生,其目前發病機制有多種學說,包括脂質浸潤、炎性反應、鈣超負荷學說、氧化應激等[12]。在臨床治療AS 的過程中,中醫藥發揮了獨有的優勢,中醫藥具有全方位和多靶點的作用特征,通過辨證論治,根據證型進行方劑加減,能夠對AS發生和發展的各個環節發生作用,臨床效果顯著。而且一些中藥復方或單味藥提取物一定程度上降低了心腦血管疾病的發病率[13]。

當歸一直是國內外學者研究的熱點,當歸及含當歸的復方制劑改善血液系統的作用廣泛，如當歸芍藥散可治療非酒精性脂肪性肝病[14],當歸芍藥散對缺血性腦卒中小鼠具有腦保護作用[15],當歸補血湯治療貧血的同時，具有抗動脈粥樣硬化作用[16-17]。岷當歸有效成分當歸揮發油和阿魏酸能減輕模型兔血管內皮的損傷,對高同型半胱氨酸血癥致兔 AS 病變有防治作用[18-19]。本研究通過中醫藥整合平臺共篩選出當歸的活性成分64 個,其中8種有效成分直接作用于AS。研究顯示，當歸的主要活性成分作用靶點主要包括炎癥基因靶點PPARG、CCL2、MMP9及脂質基因靶點MTTP、APOE、LCAT等,主要涉及炎癥反應、脂質代謝環節。這些研究也顯示預測的機制與部分研究結果一致,具有較高的準確性。本研究是基于中藥整合藥理學平臺所做的預測,具體的作用靶點及作用通路還需要實驗加以驗證。