川芎嗪聯合mTOR抑制劑調控卵巢癌SKOV-3細胞增殖、侵襲遷移的實驗研究

程春來,車 元*,丁 雯,呂曉君

0 引言

卵巢癌是女性生殖器官常見的惡性腫瘤之一,嚴重威脅女性的健康,目前臨床上對于卵巢癌的治療主要為手術治療、紫杉醇或多柔比星聯合鉑類藥物化療、靶向治療及免疫治療、放射治療等[1-3]。雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶,mTOR信號通路促進物質代謝，參與細胞凋亡、自噬，在多種疾病中發揮重要作用。近年來,研究表明，mTOR抑制劑能夠有效抑制胃癌、肺癌、卵巢癌等腫瘤細胞的增殖分化及轉移,發揮抗腫瘤作用[4-6],其中,雷帕霉素是目前已明確的第一代mTOR抑制劑。川芎嗪是從傳統中藥材川芎中提取得到的單體化合物，具有心腦血管保護作用、抗血小板聚集、改善微循環、增強機體免疫力及抗腫瘤作用[7-12]。本文主要通過研究川芎嗪聯合mTOR抑制劑對卵巢癌SKOV-3細胞增殖、侵襲遷移的作用,為卵巢癌的治療提供參考和依據。

1 材料

1.1 主要儀器 酶標儀購自北京島津公司,雙垂直電泳儀、轉印電泳儀、凝膠成像儀、流式細胞儀均購自伯樂生命醫學產品有限公司。

1.2 藥品與試劑 川芎嗪購自Sigma公司,雷帕霉素購自北京索萊寶科技有限公司,RNA提取試劑盒、PI3K、AKT、mTOR和GAPDH抗體均購自Proteintech公司,細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒、RIPA蛋白裂解液購自上海碧云天公司,ECL顯色液購自Thermo公司。RPMI1640培養基、胰蛋白酶、MTT、Transwell小室、Matrigel基質膠均購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 細胞 人卵巢腺癌細胞SKOV-3購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

2 方法

2.1 細胞培養與傳代 從-80 ℃冰箱中取出SKOV-3細胞凍存管,于37 ℃恒溫溶解后移至超凈工作臺,加入適量的 RPMI1640 培養基(含 10%胎牛血清),1 000 r/min 條件下離心 8 min。棄去上清,加入適量培養基使細胞重懸,并小心接種于培養皿中,于 37 ℃、5%CO2恒溫培養箱培養,定期更換新鮮培養液并傳代。

2.2 MTT法檢測川芎嗪聯合雷帕霉素對SKOV-3細胞增殖的影響 根據文獻方法確定川芎嗪及雷帕霉素給藥濃度[13-16],在96孔板上分別設置給藥組(分別為40 μmol/L川芎嗪組、5 μmol/L雷帕霉素組、40 μmol/L川芎嗪聯合5 μmol/L雷帕霉素組)、對照組及調零組,每組設置5個復孔,調零組只加入等量培養液,不加入細胞懸液,其余各組加入對數生長期的SKOV-3細胞,并使其密度為1×104個/ml。各組在37 ℃、5%CO2培養箱中培養24 h,對照組及調零組更換新鮮培養液,給藥組川芎嗪組加入終濃度為40 μmol/L的川芎嗪,雷帕霉素組加入終濃度為5 μmol/L的雷帕霉素、川芎嗪聯合雷帕霉素組加入終濃度為40 μmol/L的川芎嗪及終濃度為5 μmol/L的雷帕霉素,并繼續于培養箱中培養48 h。培養結束后,在避光的環境下每孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml),于培養箱中避光孵育4 h,然后吸去上清液,每孔加入150 μl DMSO,置于振蕩器上震蕩5 min至藍紫色結晶完全溶解后于酶標儀490 nm處測定OD值。按照如下公式計算細胞抑制率:

細胞抑制率(%)=

2.3 Transwell實驗檢測SKOV-3細胞侵襲能力 Matrigel基質膠融化后進行稀釋,將稀釋過的Matrigel膠包被Transwell小室底部,風干待用。取對數生長期的SKOV-3細胞,使用不含胎牛血清的RPMI1640培養基繼續培養24 h,然后收集細胞,并調整細胞密度為1×105個/ml。將Matrigel膠包被的Transwell小室置于24孔細胞培養板中,小室加入200 μl細胞懸液,下室加入600 μl含20%胎牛血清的培養基,川芎嗪組及雷帕霉素組分別加入川芎嗪(40 μmol/L)及雷帕霉素(5 μmol/L),川芎嗪聯合雷帕霉素組同時加入川芎嗪(40 μmol/L)及雷帕霉素(5 μmol/L),對照組不加藥物處理,每組重復5個樣本。置培養箱中常規培養48 h,取出小室,棄去培養液,使用PBS洗2遍,然后用70%甲醇固定30 min,臺盼藍染色,使用PBS洗3遍,用棉球輕輕拭去表面殘留細胞和凝膠,倒置顯微鏡觀察穿膜細胞數。統計各組細胞侵襲抑制率,細胞侵襲抑制率(%)=(1-給藥組穿膜細胞數/對照組穿膜細胞數)× 100%。

2.4 劃痕實驗檢測SKOV-3細胞遷移能力 取對數生長期的SKOV-3細胞,培養24 h后,對照組加入新鮮培養基,川芎嗪組及雷帕霉素組分別加入川芎嗪(40 μmol/L)及雷帕霉素(5 μmol/L),川芎嗪聯合雷帕霉素組同時加入川芎嗪(40 μmol/L)及雷帕霉素(5 μmol/L),繼續培養48 h后,將各組細胞接種于Matrigel基質膠包被的 96 孔板上,常規培養至形成單層細胞,沿培養板底部做劃痕,在顯微鏡下記錄劃痕相對距離,繼續培養24 h,再次記錄劃痕相對距離,統計細胞遷移距離,遷移距離=0 h劃痕相對距離-24 h劃痕相對距離。

2.5 實時定量PCR檢測SKOV-3細胞中Bax、Bcl-2的mRNA水平 采用RNA提取試劑盒分別提取分別經40 μmol/L川芎嗪、5 μmol/L雷帕霉素、40 μmol/L川芎嗪聯合5 μmol/L雷帕霉素作用48 h后的SKOV-3細胞的總RNA。將提取的總RNA逆轉錄成cDNA后,實時定量PCR檢測各組SKOV-3細胞中GAPDH、Bax、Bcl-2的mRNA水平。各檢測基因的實時定量PCR引物見表1,實時定量PCR結果采用2-△△Ct法計算相對表達量。

表1 用于實時定量PCR檢測的基因引物序列

2.6 Western blot檢測 將對數生長期的SKOV-3細胞于6孔板中培養至貼壁后,川芎嗪組及雷帕霉素組分別加入川芎嗪(40 μmol/L)及雷帕霉素(5 μmol/L),川芎嗪聯合雷帕霉素組同時加入川芎嗪(40 μmol/L)及雷帕霉素(5 μmol/L),各組繼續培養48 h后,分別加入裂解液提取總蛋白,采用BCA法測定蛋白濃度,處理好待測樣品后,取50 μg蛋白進行SDS-PAGE電泳分離,轉膜,將分離的蛋白電轉移至PVDF膜上。封閉液室溫封閉1 h后,經PI3K、Akt、mTOR抗體(1∶1 000)孵育,4 ℃過夜。PBST充分洗膜后,加入二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h,PBST清洗后顯色液顯影,利用凝膠成像儀成像后,應用Image J軟件進行免疫印跡灰度值檢測。

2.7 細胞周期檢測 分別取經40 μmol/L川芎嗪、5 μmol/L雷帕霉素、40 μmol/L川芎嗪聯合5 μmol/L雷帕霉素作用48 h后的SKOV-3細胞,用PBS洗2遍后,加入預冷的70%乙醇固定,過夜。次日取出,離心(2 500 r/min,5 min,4 ℃),用移液槍吸除上清液,渦旋震蕩使SKOV-3細胞松散。用PBS洗滌SKOV-3細胞2次,然后加入已配好的碘化丙啶染色液,37 °C染色30 min后,利用流式細胞儀,進行細胞周期檢測。

3 結果

3.1 川芎嗪聯合雷帕霉素對SKOV-3細胞增殖的影響 川芎嗪聯合雷帕霉素對SKOV-3細胞的增殖抑制率見圖1。結果表明,與對照組相比,川芎嗪組、雷帕霉素組及川芎嗪聯合雷帕霉素組OD值均顯著降低(P<0.05),表明單獨或聯合使用川芎嗪和雷帕霉素均能明顯抑制SKOV-3細胞的增殖;與川芎嗪組或雷帕霉素組相比,川芎嗪聯合雷帕霉素組能夠使SKOV-3細胞的增殖抑制率顯著提高(P<0.05),提示川芎嗪聯合雷帕霉素能夠顯著抑制卵巢癌細胞的增殖,且作用效果優于單獨使用川芎嗪或雷帕霉素。

圖1 川芎嗪聯合雷帕霉素對SKOV-3細胞的增殖抑制率

3.2 川芎嗪聯合雷帕霉素對SKOV-3細胞侵襲力的影響 各組SKOV-3細胞侵襲力見圖2。結果表明,與對照組相比,川芎嗪組、雷帕霉素組及川芎嗪聯合雷帕霉素組SKOV-3細胞穿膜細胞數均顯著減少(P<0.05),同時,與川芎嗪組或雷帕霉素組相比,川芎嗪聯合雷帕霉素組SKOV-3細胞侵襲抑制率顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)，提示川芎嗪聯合雷帕霉素能夠有效抑制卵巢癌細胞的侵襲力,且侵襲抑制率優于單獨使用川芎嗪或雷帕霉素。

圖2 各組SKOV-3細胞Transwell實驗結果(40)

3.3 川芎嗪聯合雷帕霉素對SKOV-3細胞遷移力的影響 各組SKOV-3細胞遷移距離見圖3。結果表明,與對照組相比,川芎嗪組、雷帕霉素組及川芎嗪聯合雷帕霉素組SKOV-3細胞遷移距離顯著縮短(P<0.05),提示單獨使用川芎嗪或雷帕霉素,或川芎嗪與雷帕霉素聯合使用均能明顯抑制卵巢癌細胞的遷移力;與川芎嗪組或雷帕霉素組相比,川芎嗪聯合雷帕霉素組SKOV-3細胞遷移距離顯著縮短，差異有統計學意義(P<0.05),提示川芎嗪聯合雷帕霉素能夠明顯抑制卵巢癌細胞的遷移力,其作用效果優于單獨使用川芎嗪或雷帕霉素。

圖3 各組SKOV-3細胞劃痕實驗結果(40×)

3.4 川芎嗪聯合雷帕霉素對SKOV-3細胞Bax、Bcl-2的mRNA水平的影響 各組SKOV-3細胞Bax、Bcl-2的mRNA水平見圖4。結果表明,與對照組相比,川芎嗪組、雷帕霉素組及川芎嗪聯合雷帕霉素組SKOV-3細胞Bax mRNA水平顯著升高(P<0.05),Bcl-2水平顯著降低(P<0.05);同時,與川芎嗪組或雷帕霉素組相比,川芎嗪聯合雷帕霉素組SKOV-3細胞Bax mRNA水平顯著升高(P<0.05),Bcl-2 mRNA水平顯著降低(P<0.05)，提示川芎嗪聯合雷帕霉素能夠顯著提高卵巢癌細胞內Bax水平,降低Bcl-2水平,這可能與川芎嗪聯合雷帕霉素促進卵巢癌細胞凋亡機制有關。

3.5 川芎嗪聯合雷帕霉素對SKOV-3細胞PI3K、Akt、mTOR水平的影響 各組SKOV-3細胞PI3K、Akt、mTOR水平見圖5。結果表明,與對照組相比,川芎嗪組、雷帕霉素組及川芎嗪聯合雷帕霉素組SKOV-3細胞PI3K、Akt、mTOR水平均顯著降低(P<0.05),同時,與川芎嗪組或雷帕霉素組相比,川芎嗪聯合雷帕霉素組SKOV-3細胞PI3K、Akt、mTOR水平顯著降低(P<0.05),提示川芎嗪聯合mTOR抑制劑可能通過調節卵巢癌細胞中PI3K/Akt/mTOR信號通路相關蛋白水平,從而起到對卵巢癌細胞的抑制作用。

圖4 各組SKOV-3細胞Bax、Bcl-2的mRNA水平

圖5 各組SKOV-3細胞PI3K、Akt、mTOR水平

3.6 川芎嗪聯合雷帕霉素對SKOV-3細胞周期的影響 見圖6。結果表明,與對照組相比,川芎嗪組、雷帕霉素組及川芎嗪聯合雷帕霉素組G1期SKOV-3細胞顯著增加(P<0.05);與川芎嗪組或雷帕霉素組相比,川芎嗪聯合雷帕霉素組G1期SKOV-3細胞顯著增加(P<0.05)，提示川芎嗪聯合mTOR抑制劑能夠顯著影響卵巢癌細胞周期,改變卵巢癌細胞分裂過程,引起卵巢癌細胞G1/S期阻滯,從而抑制卵巢癌細胞的增殖,起到腫瘤抑制作用。

圖6 川芎嗪聯合雷帕霉素對SKOV-3細胞周期的影響

4 討論

近年來，隨著眾多學者對于川芎嗪的深入研究,川芎嗪對多種腫瘤的藥理活性逐漸被發現。Chen等[17]研究表明,川芎嗪能夠通過抑制血管內皮生長因子誘導的血管生成,進而抑制黑色素瘤轉移;黃芬等[18]研究證實，川芎嗪聯合CIK細胞能通過下調細胞基質金屬蛋白酶-2,上調基質金屬蛋白酶抑制劑-2蛋白表達,抑制骨架微絲重排,進而抑制肝癌HepG2細胞的遷移及侵襲;楊劭劼等[19]發現，川芎嗪可以通過影響PTEN/AKT/cyclinD1信號通路,進而誘導外陰鱗癌細胞SW962的凋亡,并抑制其轉移和侵襲;李高兵等[20]則證實了川芎嗪能夠抑制Wnt信號通路的激活,進而抑制人肺癌細胞A549細胞的增殖、侵襲和遷移;來岳標等[21]發現，對于耐藥肺癌細胞,川芎嗪也表現出顯著的促凋亡作用,并參與調節絲裂原活化蛋白激酶信號通路;同時,殷娟等[22]發現，川芎嗪可以通過調節基質金屬蛋白酶-9的表達,抑制IL-8誘導的SKOV3細胞遷移。而川芎嗪聯合mTOR抑制劑雷帕霉素對于卵巢癌細胞的抗腫瘤活性,目前尚未見報道。本文研究川芎嗪聯合mTOR抑制劑雷帕霉素對于卵巢癌SKOV-3細胞的作用,結果表明,川芎嗪聯合雷帕霉素能夠顯著抑制卵巢癌SKOV-3細胞的增殖,抑制SKOV-3細胞侵襲、遷移,同時促進SKOV-3細胞促凋亡基因的表達,抑制抗凋亡基因的表達,抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路的異常激活,其作用效果顯著優于單獨使用川芎嗪或單獨使用雷帕霉素,這為后期深入研究川芎嗪聯合mTOR抑制劑對細胞內信號轉導通路及基因的靶向調節作用提供了基礎。此外,本研究結果表明，川芎嗪聯合mTOR抑制劑能夠顯著影響卵巢癌細胞周期,引起卵巢癌細胞G1/S期阻滯,這提示川芎嗪聯合mTOR抑制劑可能對其他影響細胞周期相關通路存在潛在或反饋調節作用,值得進一步研究。由于時間及儀器等條件的限制,本研究未能進一步探討川芎嗪聯合mTOR抑制劑對細胞內基因的靶向調節作用,同時,川芎嗪與mTOR抑制劑的聯合使用比例對細胞周期、相關信號通路是否具有不同的作用強度,在今后的研究中將進一步探討。

綜上所述,川芎嗪聯合mTOR抑制劑能夠顯著抑制卵巢癌SKOV-3細胞增殖、侵襲和遷移,其機制可能與調節PI3K/Akt/mTOR信號通路有關。