龍膽苦苷對慢性前列腺炎的作用及對NF-κB和MAPKs信號通路活化的研究

艾依熱提·買買提，木拉提·熱夏提

0 引言

慢性前列腺炎(Chronic prostatitis，CP/CPPS)是男性常見疾病之一，發病率在2.5%～16.0%之間，嚴重影響患者的生活質量[1]。臨床主要表現為下腹疼痛、墜脹，同時出現排尿異常，表現為尿急、尿頻、排尿困難及夜尿等[2]。目前，CP/CPPS的發病機制和病因尚不清楚。多種理論對CP/CPPS的病理發展做了解釋，主要包括微生物感染、自身免疫理論、神經源性炎癥理論、局部激素異常理論及尿液反流理論[3]。近年來，隨著CP/CPPS動物模型和臨床患者數據的發展，越來越多的證據表明，自身免疫在CP/CPPS的發病機制中起著重要作用[4]。國內外學者已通過不同方法成功制備了自身免疫性相關的CP/CPPS動物模型[5]。朱閩等[6]使用前列腺蛋白提純液輔以免疫佐劑等制備實驗性自身免疫性前列腺炎(EAP)小鼠模型。同樣，尹學來等[7]按雙縮脲法測定蛋白含量，以生理鹽水稀釋再加等量完全弗氏佐劑乳化成功制備了Wistar大鼠EAP模型。因此，隨著EAP動物模型的發展，對后續的藥物干預研究治療過程起著至關重要的作用。

龍膽苦苷(Gentiopicrin)是一種環烯醚萜苷類化合物，是傳統中藥龍膽的主要活性成分之一。研究表明，龍膽苦苷具有抗炎抑菌、鎮痛、肝臟保護及抗腫瘤等多種活性，且龍膽顆粒(龍膽是其主要成分之一)能夠治療慢性前列腺炎[8-9]。但是，龍膽苦苷對慢性前列腺炎的作用及相關分子機制尚不清晰，因此，本研究采用弗氏佐劑誘導的CP/CPPS大鼠模型評價龍膽苦苷的抗慢性前列腺炎作用及相關分子機制。

1 材料與方法

1.1 試藥 60只雄性成年SD大鼠(220～250 g)購自新疆醫科大學動物實驗中心。龍膽苦苷購自成都瑞芬思生物科技有限公司(成都，中國)；IL-6、IL-1β、TNF-α、COX-2及PGE2 ELISA大鼠試劑盒購自達科為(北京，中國)；前列康片購自浙江康恩貝制藥股份有限公司(杭州，中國)；抗-p-p65、p65、p-ERK、ERK、p-JNK、JNK、p-p38、p38和GAPDH(CST，美國)；RIPA蛋白裂解液(中)、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑(碧云天，中國)；HRP標記山羊抗兔IG、HRP標記山羊抗鼠IG(Abcam，英國)。

1.2 CP/CPPS大鼠模型建立 將60只雄性成年SD大鼠(220～250 g)隨機分為假手術組(C組)、模型組(M組)、龍膽苦苷150 mg/kg組(L組)、龍膽苦苷300 mg/kg組(E組)、龍膽苦苷600 mg/kg組(H組)及陽性藥組(P組)，每組10只。麻醉SD大鼠，剖開腹腔完全暴露前列腺，龍膽苦苷和模型組大鼠前列腺注射100 μl完全弗氏佐劑免疫誘導CP/CPPS大鼠模型，對照組注射等體積生理鹽水，術后縫合傷口，連續肌肉注射抗生素(氨芐青霉素，4×104U/d)4 d。龍膽苦苷組大鼠灌胃給予龍膽苦苷，假手術組(C組)和模型組(M組)均給予等體積的生理鹽水，陽性藥組灌胃給予前列康片500 mg/kg，1次/d，連續10 d。實驗結束后，稱重并脫頸椎處死大鼠，解剖分離大鼠前列腺并稱重，計算前列腺器官指數。

1.3 HE染色 實驗結束后，脫頸椎處死大鼠，解剖分離大鼠前列腺，將其取出并在4%多聚甲醛中固定24 h，然后石蠟包埋。在切片機上切成4 μm切片，二甲苯脫蠟，酒精脫水。然后，蘇木精染色3 min，曙紅染色1 min。在光學顯微鏡下觀察切片，以評估前列腺炎癥反應。

1.4 ELISA檢測 采用ELISA法檢測大鼠前列腺組織中白細胞介素(IL)-6、IL-1β、腫瘤壞死因子(TNF-α)及COX-2、PGE2分泌水平，收集大鼠前列腺組織，加入生理鹽水0.5 ml，組織研磨儀勻漿，600×g離心15 min，收集上清，根據制造商的說明采用ELISA試劑盒檢測大鼠前列腺中IL-6、IL-1β、TNF-α及COX-2和PGE2的含量。

1.5 誘導型NO酶活性檢測 采用酶活性檢測試劑盒(南京建成，南京，中國)檢測前列腺組織上清iNOS的酶活性，收集大鼠前列腺組織，加入生理鹽水0.5 ml組織研磨儀勻漿，600×g離心15 min，收集上清，根據說明檢測大鼠前列腺iNOS的酶活性。

1.6 蛋白免疫印跡(Western blot)法檢測有關指標 分離收集實驗大鼠的前列腺組織，稱取約30 mg，加入1 ml蛋白裂解液，研磨儀組織勻漿，采用Western blot檢測前列腺組織p-p65、p65、p-ERK和ERK、p-JNK和JNK及p-p38和p38蛋白表達水平。根據說明提取組織總蛋白，采用BCA法(碧云天，中國)進行蛋白定量，加入Loading buffer(4×)于100 ℃煮沸5 min，然后采用SDS-PAGE電泳分離蛋白，電泳條件：80 V，30 min；120 V，60 min。隨后采用100 V，90 min將電泳分離后的蛋白轉移至聚偏佛乙烯(PVDF)膜(Millipore，美國)，用5% 脫脂乳室溫封閉60 min，TBST洗滌5次，每次5 min，用一抗(p-p65、p65、p-ERK和ERK、p-JNK和JNK及p-p38和p38及GAPDH，按1∶1 000稀釋)4 ℃孵育過夜，TBST洗滌5次，5 min/次，用二抗(HRP標記山羊抗兔IG和HRP標記山羊抗鼠IG，按1∶10 000稀釋)室溫孵育90 min，TBST洗滌5次，5 min/次，用ECL化學發光法(Millipore，MA)顯影檢測，Image J分析灰度值。

2 結果

2.1 龍膽苦苷對CP/CPPS大鼠前列腺器官指數及病理學的影響 與C組相比，M組大鼠的前列腺器官指數顯著升高(P<0.05)，與M組相比，灌胃給予龍膽苦苷顯著降低CP/CPPS大鼠的前列腺器官指數(P<0.05)，見圖1。病理HE染色結果表明，與C組相比，M組大鼠前列腺基質出現局灶性淋巴細胞浸潤、上皮明顯增厚、腔內折疊及腺泡顯著變小和間質增生，灌胃給予龍膽苦苷能夠顯著減輕CP/CPPS的病理學變化，包括局灶性淋巴細胞浸潤減少、上皮增厚及間質增生抑制等，見圖2。

圖1 龍膽苦苷對CP/CPPS大鼠前列腺器官指數的影響

2.2 龍膽苦苷對CP/CPPS大鼠前列腺組織中炎癥因子表達的影響 采用ELISA法檢測大鼠前列腺組織中炎癥因子IL-6、IL-1β和TNF-α表達水平，結果表明，與C組相比，M組大鼠前列腺組織中炎癥因子IL-6、IL-1β和TNF-α的含量顯著增加，灌胃給予龍膽苦苷能夠顯著降低CP/CPPS大鼠前列腺組織中炎癥因子IL-6、IL-1β和TNF-α的含量(P<0.05)，見圖3。

圖2 龍膽苦苷對CP/CPPS大鼠前列腺病理學影響(HE病理染色結果)

圖3 龍膽苦苷對CP/CPPS大鼠前列腺組織中炎癥因子表達的影響

2.3 龍膽苦苷對CP/CPPS大鼠前列腺組織炎癥介質的影響 采用ELISA法檢測大鼠前列腺組織中COX-2、PGE2的含量，結果表明，與C組相比，M組大鼠前列腺組織中COX-2和PGE2的含量顯著增加，灌胃給予龍膽苦苷顯著降低CP/CPPS大鼠前列腺組織中COX-2和PGE2的含量(P<0.05)，見圖4A、4B。同時，與C組相比，M組大鼠前列腺組織中iNOS酶活性顯著增加，灌胃給予龍膽苦苷顯著抑制CP/CPPS大鼠的前列腺組織中iNOS酶活性(P<0.05)。見圖4C。

2.4 龍膽苦苷對CP/CPPS大鼠前列腺組織中NF-κB信號通路活化的影響 采用Western blot法檢測大鼠前列腺組織中NF-κB信號通路分子的蛋白水平，結果表明，與C組相比，M組大鼠前列腺組織中p-p65蛋白表達水平顯著上調(P<0.05)，但p65蛋白表達水平變化差異無統計學意義(P>0.05)，灌胃給予龍膽苦苷能夠顯著下調CP/CPPS大鼠前列腺組織p-p65的蛋白表達水平(P<0.05)，見圖5。

2.5 龍膽苦苷對CP/CPPS大鼠前列腺組織中MAPKs信號通路活化的影響 采用Western blot法檢測大鼠前列腺組織中MAPKS信號通路分子的蛋白水平，結果表明，與C組相比，M組大鼠前列腺組織中p-ERK/ERK、p-JNK/JNK及p-p38/p38蛋白表達水平顯著上調，灌胃給予龍膽苦苷顯著下調CP/CPPS大鼠前列腺組織中p-ERK/ERK、p-JNK/JNK及p-p38/p38蛋白表達水平(P<0.05)，見圖6。

3 討論

CP/CPPS病理機制復雜，隨著CP/CPPS動物模型和患者數據的增加，越來越多的研究認識到自身免疫在CP/CPPS病理機制中的重要作用[10]。因此，本研究采用完全弗氏佐劑(CFA)誘導的自身免疫性CP/CPPS動物模型評價了龍膽苦苷的抗CP/CPPS作用及相關分子機制。

圖4 龍膽苦苷對CP/CPPS大鼠前列腺組織中炎癥介質表達的影響

圖5 龍膽苦苷CP/CPPS大鼠前列腺組織中NF-κB信號通路活化的影響

CFA誘導的CP/CPPS動物模型與前列腺的病理組織變化密切相關，表現為明顯的前列腺受損、炎性細胞浸潤及水腫和細胞間質纖維化，這些變化和之前的報道一致，而且這種模型復制方法易于操作[10]。同時，這些變化與非細菌性CP/CPPS患者臨床癥狀相一致，有助于CP/CPPS的病理機制和藥物干預研究。本研究表明，龍膽苦苷能夠顯著抑制CP/CPPS大鼠前列腺炎性細胞浸潤、間質水腫及纖維化，同時降低前列腺的器官指數，這表明龍膽苦苷對CP/CPPS具有潛在的治療價值。

近年來，越來越多的研究將注意力集中于炎癥因子及炎癥介質在CP/CPPS病理機制中的作用[11]。IL-1β和TNF-α作為兩種重要的促炎因子，在CP/CPPS的病理發展過程中起著至關重要的作用[12]。IL-6作為機體炎癥反應的主要免疫因子，能夠調節IL-2的產生及下游IL-1β和TNF-α的合成[13]。本研究結果表明，龍膽苦苷能夠抑制CP/CPPS大鼠前列腺中炎癥因子包括IL-1β、IL-6及TNF-α的產生。同時，IL-1β和TNF-α作為炎癥反應的關鍵因子，能夠激活核因子-κB(NF-κB)信號通路，促進促炎因子及炎癥介質COX-2、PGE2及iNOS的產生和釋放[14-15]。本研究表明，龍膽苦苷也能夠抑制COX-2、PGE2的產生及iNOS活性。因此，龍膽苦苷可能通過抑制炎癥因子及炎癥介質的釋放發揮抗CP/CPPS作用。

圖6 龍膽苦苷CP/CPPS大鼠前列腺組織中MAPKs信號通路活化的影響

NF-κB信號通路在機體的炎癥反應調節過程中起著至關重要的作用，正常情況下，p65或p50與IκBα形成共聚體存在于細胞質中，當受到細胞外信號的刺激(IL-1β和TNF-α)，IκBα發生磷酸化并降解，p65或p50磷酸化進入細胞核，進而調節促炎因子(IL-1β、IL-6及TNF-α)及COX-2、PGE2等炎癥介質的轉錄表達[16]。除此之外，絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路是生物體內重要的信號轉導通路，其亞族主要包括JNK、ERK及p38，參與介導細胞的生長、分化及發育等多種過程，在機體炎癥調節過程中發揮著重要的作用[17]。在本研究中，龍膽苦苷能夠抑制p65的磷酸化及JNK、ERK和p38磷酸化，因此，龍膽苦苷可能通過抑制NF-κB和MAPK信號通路的活化產生抗炎作用。

綜上所述，本研究表明，龍膽苦苷對慢性前列腺炎具有保護作用，并且這種作用可能與抑制NF-κB和MAPK信號通路激活有關。但是，龍膽苦苷是直接還是間接作用于NF-κB和MAPK信號通路及其他信號通路，尚需進一步探討。