廣西百色市及其周邊人群LAG-3基因多態性與原發性肝癌易感性的關系

韋建開，廖長秀2，陶瑩，劉帥廷

(1. 右江民族醫學院基礎醫學院，廣西 百色 533000；2. 右江民族醫學院藥學院，廣西 百色 533000)

原發性肝癌(primary liver cancer，PLC)在全球癌癥死亡率中排名第四，占所有癌癥死亡人數的8.2%[1]，是我國發病率和死亡率相對較高的惡性腫瘤之一。PLC屬于高度免疫抑制型腫瘤，突變負荷和免疫原性較高，腫瘤邊緣存在一定數量的T細胞浸潤，但是腫瘤中心T細胞的數量一般較少，且浸潤T細胞常常處于功能耗竭狀態[2-3]。T細胞耗竭的主要特征為其表面負性共刺激分子表達水平升高，相關細胞因子分泌減少和效應T細胞殺傷能力下降，導致腫瘤細胞出現免疫逃逸而促進腫瘤的發生發展。因此，肝癌患者免疫負性共刺激分子的功能可能與肝癌發生密切相關。

淋巴細胞活化基因-3(lymphocyte activation gene-3，LAG-3)分子為重要的負性共刺激分子之一，多表達于活化的CD4+和CD8+T細胞。已經有研究發現，LAG-3的表達與PLC有相關性，且肝癌組織上的表達遠高于癌旁組織[4]。在PLC患者TIL中的CD8+T細胞表面表達較外周血淋巴細胞顯著增高。已有研究報道肝癌患者其他免疫負性共刺激分子如細胞程序性死亡受體-1(programmed death 1，PD-1)、T細胞免疫球蛋白及黏蛋白-3(T cell immunoglobulin and mucin domain-3，TIM-3)單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)與肝癌易感性密切相關[5-6]，但關于LAG-3 SNP與肝癌之間的關系尚未見報道。本文收集廣西百色市及其周邊地區PLC患者及健康對照者各300例，采用多重PCR及高通量測序法測定兩組人群DNA LAG-3 rs1882545等位基因，分析兩組人群LAG-3 rs1882545位點等位基因和基因型分布頻率是否存在差異，以探討LAG-3在肝癌發生發展中作用，為肝癌易感人群的篩選提供依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象 查閱病例，收集籍貫為廣西百色市或百色市周邊并且于2018年9月—2020年7月在右江民族醫學院附屬醫院住院的PLC患者300例，其中男性261例，女性39例，年齡為23～75歲，平均年齡為(51.2±11.1)歲，<55歲者191例，≥55歲者109例；同時收集肝炎項目檢查正常即無肝炎性感染且AFP、AST、ALT、血常規各項指標正常300例為對照組，其中男性255例，女性45例，年齡為23～82歲，平均年齡為(51.9±9.0)歲，<55歲者184例，≥55歲者116例。兩組對象在平均年齡、性別、年齡構成方面差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。所有入選樣本均為互無血緣關系的廣西百色市及其周邊人群。根據知情同意原則，告知患者家屬研究目的及風險等，取得同意并簽署知情同意書，本研究經過右江民族醫學院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 采集外周血2 ml，按試劑盒說明采用倍沃醫學科技公司血液基因組提取試劑盒(批號：231101200708)提取外周血白細胞中的基因組DNA。肝癌組樣本所提取DNA濃度在11.50～338.20 ng/μl之間，對照組樣本所提取DNA濃度大部分在10.65～349.75 ng/μl之間，提取所得的DNA完整性用瓊脂糖電泳進行鑒定，所得DNA樣本均符合送檢要求。

1.2.2 LAG-3 rs1882545基因分型采用多重擴增及高通量測序方法進行 設計并合成好適合rs1882545 SNP位點的引物，上游引物為：5′-TGAGCCGTCTACATAAAACAGTTGA-3′，下游引物為：5′-GATAATACATCTCCTGAAGGCCAAT-3′。通過兩步PCR的方法完成目標SNP位點序列的擴增和兼容Illumina測序文庫的制備。第一輪PCR體系如下：DNA模板(10 ng/μl)2 μl、上游(10 μM)和下游引物(10 μM)各1 μl和2×PCR Ready Mix 15 μl(總體積25 μl)(Kapa HiFi Ready Mix)。在PCR儀(BIO-RAD，T100TM)上執行擴增檢測，循環參數設定如表1(第一輪第1次和第2次)，PCR反應完成后，使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，確定產物大小正確，使用AMPure XP磁珠純化回收PCR產物。然后以第一輪PCR產物為模板執行第二輪PCR反應，以獲得測序帶分子標簽的文庫。反應體系如下：DNA模板(10 ng/μl)2 μl、通用P7引物(含分子標簽，10 μM)1 μl、通用P5引物(10 μM)1 μl和 2× PCR Ready Mix 15 μl (總體積30 μl)。配制好反應體系后，執行如下PCR程序如表1(第二輪)。最終PCR產物使用AMPure XP磁珠純化回收，使用HiSeqXTen測序儀(Illumina, San Diego，CA)進行測序。設置軟件參數，進行數據質控，篩選、刪除、比對、分析等，得出目標基因型結果，再通過軟件對突變位點進行基因注釋。

1.3 統計學方法 采用SPSS 20.0統計軟件進行統計分析。用擬合優度χ2檢驗檢測基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡；用χ2檢驗先檢測等位基因和基因型在PLC組和對照組的頻率分布差異，用非條件Logistic回歸計算比值比(odds rati，OR)及其95%可信區間(95%CI)評價各等位基因、基因型與PLC發生的關系。利用Ensembl網站(http://asia.ensembl.org/)公布的5個地區人群(中國南方漢族、北京漢族、日本東京、尼日利亞和意大利亞托斯卡尼人群)基因多態性rs1882545位點基因型和基因分布頻率結果，采用χ2檢驗分析廣西百色市及其周邊人群與這些人群該位點基因型和等位基因頻率的分布差異，以P<0.05為差異有統計學意義。

表1 各步PCR循環參數設定情況

2 結果

2.1 健康對照人群LAG-3 rs1882545等位基因分布及與其他國家(地區)人群的比較 廣西百色市及其周邊健康對照人群LAG-3 rs1882545位點除1例未測出基因型，余299例DNA樣本均測出，以G等位基因為主，占70.57%，GG、GA、AA 3種基因型分布頻率分別為50.50%、40.13%、9.37%，符合Hardy-Weinberg平衡。LAG-3 rs1882545位點基因型和等位基因頻率與中國南方漢族和尼日利亞人群比較差異無統計學意義(P>0.05)，但與北京漢族、日本東京、意大利托斯卡尼比較差異有統計學意義(P<0.01)，見表2。

表2 不同種族及地區人群LAG-3 rs1882545位點多態性分布頻率的比較

2.2 PLC人群LAG-3 rs1882545等位基因分布與健康對照人群的比較 廣西百色市及其周邊PLC人群300例DNA樣本均測出LAG-3 rs1882545位點等位基因，GG、GA、AA 3種基因型分布頻率分別為45.00%、45.67%、9.33%，符合Hardy-Weinberg平衡。χ2檢驗比較兩組基因型及等位基因rs1882545分布頻率，發現兩組差異無統計學意義(P>0.05)。經非條件Logistic回歸分析，校正性別和年齡因素后結果顯示，rs1882545基因型和等位基因分布頻率與PLC的患病風險均無關(P>0.05)。結果見表3。

表3 LAG-3 rs18825454與PLC患病風險的關系

2.3 LAG-3 rs1882545與PLC易感性的分析 性別分層分析中男性及年齡分層(<55歲和≥55歲)PLC組和健康對照組LAG-3 rs1882545等位基因和基因型分布頻率差異無統計學意義(P>0.05)，經非條件Logistic回歸分析，也與PLC的患病風險均無關(P>0.05)。結果見表4和表5。廣西百色市及其周邊地區女性PLC組和相應健康對照組LAG-3 rs1882545基因型分布頻率無統計學差異，但女性PLC組A等位基因頻率明顯高于相應健康對照組，經χ2檢驗計算(χ2=4.146，P=0.042)，提示女性攜帶A基因與患PLC有關；經非條件Logistic回歸分析，發現女性人群與患PLC的風險有關聯(P=0.042，OR=1.959，95%CI：1.017～3.771)，提示攜帶A等位基因患肝癌相對本次實驗健康人群的風險增加，見表4。

表4 LAG-3 rs18825454與PLC患病風險的性別分層分析

表5 LAG-3 rs18825454與PLC患病風險的年齡分層分析

3 討論

本研究收集廣西百色市及其周邊PLC患者300例，對其進行年齡和性別分層時發現<55歲年齡的人群為主，占比為63.67%，同時以男性患者居多(87.00%)，這與林子博等[7]學者報道的廣東順德地區PLC人群男性患者為主且年齡在22～55歲居多相一致。眾所周知慢性乙型病毒性肝炎(乙肝)是PLC發病的獨立危險因素[8]；劉慧妮[9]曾報道廣西百色市乙肝感染人群以男性居多，而且年齡以20～55歲占大比例，提示慢性乙肝可能是廣西百色市及其周邊人群PLC患者以男性居多且呈年輕化的原因。這與文獻報道我國肝癌患者男性遠高于女性，年齡呈年輕化，已由原來的40～50歲提前至35～50歲的結果相一致[10]。

LAG-3也稱CD223，分子量為70 kDa，定位于人12號染色體 (12 p13.3)。作為免疫檢查點家族的一員，LAG-3是T細胞功能的抑制性分子，多種腫瘤微環境中有異常表達，參與腫瘤的免疫逃逸，進一步促進腫瘤的發生發展[11]。有研究報道肝癌腫瘤浸潤淋巴細胞上LAG-3陽性表達為65.00%，可能在肝癌發生發展中具有重要的作用[12]。已知SNP可使基因結構或表達量發生變化，在個體對某些藥物的反應、對環境因素(如毒素)的敏感性、發展特定疾病的風險(特別是個體腫瘤遺傳易感性)等方面發揮重要的作用[13]。目前研究LAG-3基因多態性較少。已有研究報道LAG-3 rs19922452、rs951818和rs870849基因多態性與多發性硬化的易感性相關，rs19922452 TT、rs951818 GG和rs870849 CT基因型使多發性硬化的風險降低[14]。劉愛娟[15]通過聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性方法(PCR-RFLP)分析CD4基因rs2515733多態性位點基因頻率和LAG-3基因rs870849多態性位點基因頻率在特發性血小板減少性紫癜患者組與對照組之間無顯著差異。這些研究表明LAG-3的不同位點在同一疾病、同一個位點與不同疾病的關聯性均具有差異性。

本研究收集廣西百色市及周邊健康對照者和PLC患者各300例，采用多重擴增及高通量測序測定LAG-3 rs1882545位點等位基因。結果發現廣西百色市及其周邊健康對照人群LAG-3 rs1882545位點，以G等位基因為主，占70.57%，GG、GA、AA 3種基因型分布頻率分別為50.50%、40.13%、9.37%，基因型和等位基因分布頻率與中國南方漢族和尼日利亞人群比較差異無統計學意義，提示本研究的基因分型方法具有一定的可信性。本研究結果也發現本文健康對照人群LAG-3 rs1882545基因型和等位基因分布頻率與北京漢族、日本東京、意大利托斯卡尼比較差異有統計學意義，提示LAG-3rs1882545基因多態性具有種族和地域差異。

本研究發現雖然在不分層或年齡分層或男性廣西百色市及周邊人群LAG-3 rs1882545等位基因和基因型分布頻率 PLC患者與健康對照患者比較差異無統計學意義，但在女性人群中PLC患者A等位基因頻率(42.31%)明顯高于健康對照人群(27.27%)，差異有統計學意義，且攜帶A等位基因患PLC風險明顯增加(OR=1.959，95%CI：1.017～3.771)。由于納入本次研究的女性病例數較少，需要增加更多的女性病例數進一步來確認其相關性。

綜上所述，本研究發現在廣西百色市及其周邊人群中以男性年齡25～55歲為主，LAG-3 rs1882545基因型、等位基因分布頻率具有種族和地域差異，LAG-3 rs1882545 A等位基因可能與廣西百色市及其周邊女性人群PLC易感性有關，為廣西百色市及其周邊地區女性肝癌易感人群的篩選提供一定的理論依據。由于本次研究病例來源和病例數的局限性，需要后續增加病例數來進一步深入研究。