姜黃素聯合順鉑通過內質網應激信號通路抑制腺樣囊性癌ACC-M細胞增殖作用的研究

[遵義醫科大學第五附屬(珠海)醫院口腔頜面外科，廣東 珠海 519100]

涎腺腺樣囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma，SACC)是口腔頜面部常見的唾液腺惡性腫瘤，目前治療方法仍以手術為主，輔以放化療。順鉑是治療腺樣囊性癌常見的化療藥物，然而，它的應用受到耐藥性和副作用的限制。因此，開發與順鉑協同作用并減少副作用的新藥物具有重要意義。研究表明，姜黃素聯合順鉑在多種腫瘤中發揮協同作用[1-2]。本研究探討姜黃素聯合順鉑對腺樣囊性癌ACC-M細胞的抗腫瘤作用及其對內質網應激相關蛋白GRP78、p-elF2α、CHOP、p-JNK蛋白表達的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器 ACC-M細胞株購自廣州華拓生物科技有限公司，姜黃素(Curcumin,Cur)、順鉑(cisplatin,DDP)、胎牛血清、二甲基亞砜(DMSO)均購自合肥博美生物科技有限責任公司(批號：458-37-7、批號：15663-27-1、批號：15140-122、批號：67-68-5)、RPMI-1640均購自美國Gibco公司(批號：15140-122)，MTT試劑盒(批號：C0009S)、LDH試劑盒購自江蘇碧云天生物科技研究所(批號：C00016)、GRP78(批號：#3177)、p-elF2α(批號：#3398)、elF2α(批號：#5324)、CHOP(批號：#2895)、p-JNK(批號：#9255)、GAPDH(批號：#5174)均購自美國CST公司,鼠源二抗、兔源二抗購自美國CST公司(批號分別為：#7076、#7074)。酶標儀購自美國ThermoScientific公司，細胞培養箱購自力康生物醫療科技控股集團，96孔板細胞培養板購自Corstor公司(型號：3300)，電子天平購自德國艾科勒公司(型號：ALC-210.4)。尼康ECKIPSE TS100/TS100倒置顯微鏡購自Nikon公司。

1.2 實驗分組及細胞培養 將ACC-M細胞分為姜黃素組、順鉑組、聯合用藥組、對照組，用實驗筆標記分組名稱、時間。將ACC-M細胞置于含10%胎牛血清及1%雙抗(青霉素、鏈霉素)的RPMI-1640培養基中，于37℃、5%CO2培養箱中培養，并進行傳代，待細胞貼壁后取對數生長期細胞進行實驗。

1.3 MTT法測定細胞存活率 取對數生長期的ACC-M細胞，加入0.25%胰蛋白酶消化制備成單細胞懸液，計數并調整細胞濃度為1×104個/毫升，每孔加入100 μl細胞懸液接種于96孔板，每組設置5個復孔，置于培養箱培養過夜，然后分組給藥。實驗分組如下：對照組：加入0.1% DMSO；順鉑組(DDP組)：加入DDP(8 μM)，姜黃素組：Cur(5 μM、10 μM、20 μM、40 μM)；聯合用藥組：不同濃度(5 μM、10 μM、20 μM、40 μM)Cur聯合DDP(8 μM)。加藥處理24 h后棄上清，每孔加入1 mg/ml的MTT溶液100 μl，于培養箱中繼續孵育4 h，吸去上清，每孔加入100 μl的DMSO，選擇495 nm波長，在酶標儀上測定各孔吸光度值(OD值)，實驗重復3次。細胞存活率=(藥物干預組OD值-空白組OD/對照組OD值-空白組OD值)×100%。

1.4 LDH法測定細胞毒性 ①按實驗分組給藥，取上清液，400 g離心5 min，每組分別取120 μl置于96孔板；②配置INT溶液：將10×INT溶液稀釋至×1。按酶溶液∶INT溶液∶乳酸溶液=1∶1∶1比例配置LDH工作液，避光放置；③每組加入60 μl LDH工作液，混勻，室溫避光孵育30 min，490 nm測定每組吸光度。計算公式：LDH釋放量(%)=(處理組樣品OD值-處理組對照孔OD值)/(空白組樣品OD值-空白組對照孔OD值)×100%。

1.5 倒置顯微鏡下觀察用藥后各組細胞生長情況 取對數生長期的ACC-M 細胞，接種于6孔板中過夜，在姜黃素組、順鉑組、聯合用藥組中分別加入20 μmol/L姜黃素、8 μmol/L順鉑、20 μmol/L姜黃素+8 μmol/L順鉑進行干預，對照組中加入0.1%DMSO的完全培養基，作用24 h后，倒置顯微鏡下觀察各組細胞形態。

1.6 蛋白質印跡法測定 GRP78、p-elF2α、CHOP、p-JNK 蛋白的表達 倒置顯微鏡下觀察各種細胞形態后，分組加入細胞裂解液，4℃離心，12 000 r/min,離心5 min，吸取上清，測定蛋白濃度，使每孔上樣蛋白總量均一化(20 μg)，然后在10%SDS-PAGE凝膠上分離，轉膜，使用5%脫脂奶粉封閉2 h，然后孵育目的蛋白GRP78、p-elF2α、CHOP和p-JNK一抗(1∶1000稀釋)，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內參，4℃孵育過夜；震蕩洗膜3次，孵育二抗，4℃孵育2 h；最后采用Bio-Rad凝膠處理系統采集結果，圖片并用image J軟件對結果進行定量分析。

2 結果

2.1 姜黃素聯合順鉑對ACC-M細胞的細胞存活率和LDH釋放量的影響 用不同濃度的姜黃素單獨或聯合處理ACC-M細胞24 h，MTT實驗測定細胞存活率，收集上清液測定LDH釋放量。結果表明：見圖1，用8 μM順鉑作用細胞24 h后，與對照組相比，ACC-M細胞存活率明顯降低(見圖1A)；用不同濃度的Cur(5 μM、10 μM、20 μM、40 μM)聯合DDP(8 μM)處理ACC-M細胞，與DDP組相比，聯合用藥組的細胞存活率進一步降低(P<0.05)；在LDH釋放量得到類似的結果，其中Cur能顯著增加由DDP引起的LDH釋放量(見圖1B)。本實驗采用金正均法判斷兩種藥是否存在協同作用，Q=E(a+b)/(Ea+Eb-Ea×Eb)，當Q值>1.15時，說明具有協同增效作用，本實驗結果顯示，當8 μM 順鉑與10 μM姜黃素聯用時，計算Q值為1.24，表明兩者存在協同作用；當8 μM 順鉑與20 μM姜黃素聯用時，計算Q值為1.18，表明兩者存在協同作用；其余各組Q值為0.95～1.06，見表1。

注：與空白組比較，#：P<0.05；與順鉑組比較，*：P<0.05；Ctrl：空白對照；DDP：順鉑；Cur：姜黃素。

表1 不同濃度聯合用藥作用24 h后對ACC-M細胞Q值的影響

2.2 姜黃素聯合順鉑作用24 h后對ACC-M細胞生長情況的影響 各組細胞在加藥后24 h，倒置顯微鏡下觀察，對照組ACC-M細胞呈梭形，胞質較為豐富，細胞核位于中央。而加入姜黃素(20 μM)、順鉑(8 μM)后，細胞由梭形變為不規則形，細胞體積增大，細胞核往邊上移動，但細胞膜尚完整。同時，細胞貼壁數量減少，脫落漂浮于培養液的細胞增多，尤其在聯合用藥組(20 μM Cur+8 μM DDP)，細胞貼壁細胞明顯減少，而脫落于培養液的細胞明顯增多。見圖2。

注：黑色色箭頭代表貼壁ACC-M細胞，紅色代表死亡ACC-M細胞；Control：空白對照；DDP：順鉑；Cur：姜黃素。

2.3 姜黃素與順鉑單獨及聯合使用對ACC-M細胞GRP78、p-elF2α、CHOP、p-JNK蛋白表達水平的影響 使用8 μM的DDP和20 μM Cur單獨或聯合處理ACC-M細胞24 h后，收集蛋白檢測內質網應激相關蛋白GRP78、p-elF2α、elF2α、p-JNK和內參蛋白GAPDH的表達。與空白對照組相比，8 μM DDP處理24 h后，DDP組的內質網應激相關蛋白GRP78、p-elF2α、CHOP上調，差異有統計學意義(P<0.05)；20 μM Cur聯合DDP(8 μM)處理24 h后，GRP78、p-elF2α、CHOP、p-JNK蛋白表達明顯上調，差異有統計學意義(P<0.05)，表明姜黃素能進一步增強由順鉑誘導的內質網應激反應，見圖3。

注：與空白組比較，#P<0.05；與順鉑組比較，*P<0.05；Control(空白對照)，DDP(順鉑)，Cur(姜黃素)，Combination(聯合用藥)。

3 討論

SACC是頜下腺和舌下腺最常見的上皮性涎腺惡性腫瘤，占腮腺惡性腫瘤的7%～18%，占小涎惡性腫瘤的35%～58%。SACC可發生在所有年齡段，在50～60歲中老年患者中出現頻率更高，臨床上以神經浸潤和多發性局部復發為特征[3-4]。目前，SACC的治療以手術為主，即使進行根治性手術治療，5～10年的復發率仍較高[5]，所以目前多主張術后輔以放化療。術后放療被認為可以局部控制腫瘤進展，但5年后復發率仍可達到一半[6]。此外，即使局部控制的病人仍可能在輻射場外或遠處復發，術后輔以化療越來越得到研究者的認可。順鉑是治療癌癥的傳統一線化療藥物[7-8]，其可以誘導DNA-蛋白質以及鏈間和鏈內DNA交聯，盡管這種交聯可以誘導細胞凋亡并抑制細胞增殖，但是順鉑的有效性受到細胞耐藥性及毒性的限制，包括遺傳毒性、腎毒性和急性骨髓毒性[9-10]。為了減少順鉑的耐藥及其毒副作用，增強順鉑的抗腫瘤效果，臨床上常將順鉑與其他藥物聯合使用，中藥因其藥理作用廣，同時毒副作用小而成為理想選擇。

姜黃素是從姜黃根莖中提取的脂溶性多酚類衍生物，具有抗炎、抗氧化、降血脂、抗腫瘤等多方面的藥理作用[11-13]。在膀胱癌細胞系中，與單獨使用姜黃素或順鉑相比，10 μM姜黃素和10 μM順鉑聯合使用可明顯降低膀胱癌細胞系的生存能力，促使其調亡明顯增加[14]。Zhu X等[15]發現，與單純順鉑相比，姜黃素和順鉑聯合應用可通過調節 Twist1上調 miR-186表達，增強順鉑對卵巢癌的抑制作用。本實驗MTT及LDH試驗結果顯示，與單獨順鉑組相比，姜黃素聯合順鉑可明顯抑制ACC-M細胞增殖，增強順鉑對ACC-M細胞毒性，姜黃素聯合順鉑具有較好的協同作用，姜黃素可增強順鉑的抗腫瘤效果。

生理或病理條件下的多種刺激可誘導內質網中未折疊蛋白的積累，這將激活一種進化上保守的適應性反應，稱為內質網應激，如果刺激嚴重或持續，則會導致細胞死亡[16-17]。葡萄糖調節反應蛋白78(glucose regulated protein 78，GRP78)又稱為免疫球蛋白重鏈結合蛋白(immunoglobulin heavy chain-binding protein，Bip)，正常情況下，GRP78與內質網三種跨膜蛋白(蛋白激酶R樣內質網激酶(RNA dependent protein kinase-like ER kinase，PERK)、肌醇需求酶 1(inositol requiring enzyme 1-α，IRE1α) 和活化轉錄因子6 (activating transcription factor 6-α，ATF6α)結合并使其失活。發生ERS時，未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白與GRP78 /Bip的親和力較高，內質網腔內GRP78表達增加[18]。本實驗發現用姜黃素或聯合順鉑處理后，ACC-M細胞中GRP78表達增加，表明內質網應激激活，而聯合用藥后細胞內GRP78表達增加明顯，表明姜黃素聯合順鉑可增強內質網應激反應。PEAK通路是內質網應激發生時一條重要的信號通路，據報道其與多種腫瘤的增殖及存活有關，通過靶向PEAK信號通路而誘導細胞凋亡或自噬被認為是一個新的治療策略[19]。在這項研究中我們發現姜黃素聯合順鉑作用后ACC-M細胞內p-eIF2α表達上調，提示姜黃素聯合順鉑可能通過PERK /eIF2α信號通路激活內質網應激。

CHOP蛋白又稱為生長抑制DNA損傷基因153(growth arrest and DNA damage-inducible gene 153，GADD 153)，內質網應激三條信號通路均能誘導CHOP的表達。ATF6、ATF4或XBP1S表達上調通過與CHOP基因啟動子內的結合位點相互作用誘導細胞凋亡。我們的研究表明姜黃素或順鉑通過誘導內質網應激以激活ACC-M細胞內CHOP的表達，且聯合用藥后細胞內CHOP表達明顯增加，表明姜黃素聯合順鉑通過內質網應激誘導的CHOP信號通路從而誘導ACC-M細胞凋亡。目前，CHOP誘導細胞凋亡的下游機制仍在探索之中。其可介導Bcl-2下調和Bim上調，還可誘導促凋亡蛋白ERO1α和Puma的表達,持續的內質網應激最終導致線粒體功能障礙、細胞色素c釋放和caspase-3活化[20]。白亮等[21]研究發現姜黃素作用腺樣囊性癌后，細胞內caspase-3明顯增加，其認為將姜黃素誘導細胞凋亡的機制可能與caspase-3有關。而本實驗發現姜黃素聯合順鉑作用后細胞內CHOP蛋白明顯增加，因而我們認為姜黃素可能通過誘導CHOP表達而激活下游的caspase-3表達，而誘發ACC-M細胞凋亡。

JNK同樣是內質網應激誘導細胞凋亡中重要的信號轉導因子，在內質網應激中起重要的調控作用。當細胞發生內質網應激時，IRE1α信號通路激活，其可通過刺激凋亡信號調節激酶1(apoptosis signal regulaing kinase-1，ASK1)的激活，而后者可引起應激激酶Jun-N-末端激酶(JNK)下游激活，進而引發細胞凋亡[22]。本實驗發現姜黃素作用24 h后，ACC-M細胞內p-JNK增加，順鉑組p-JNK變化不明顯，而聯合組p-JNK蛋白表達大于單藥組，差異具有統計學意義，說明姜黃素聯合順鉑可通過介導P-JNK誘導ACC-M細胞凋亡。

綜上所述，姜黃素聯合順鉑可對ACC-M細胞產生抑制作用，其機制可能與內質網應激相關。姜黃素聯合順鉑可通過誘發ACC-M細胞內GRP78表達增加，可能通過活化PEAK-elF2α及IRE1α信號通路,進而促進CHOP及JNK介導的細胞凋亡。姜黃素屬于多靶點的生物活性藥物，其聯合順鉑對ACC的抗腫瘤作用機制是否還有其它信號通路，有待于進一步的研究。