去卵巢小鼠絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型的建立和綜合評定

(1. 右江民族醫(yī)學院研究生學院，廣西 百色 533000；2. 右江民族醫(yī)學院組織胚胎學教研室，廣西 百色 533000)

骨質(zhì)疏松癥是一種以骨量低和骨組織結構惡化為特征的疾病，導致骨折風險易感性增加。骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生率隨著年齡的增長而增加，并且由于雌激素缺乏，絕經(jīng)后婦女中骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生率最高，因為骨吸收和骨形成之間的平衡朝著骨吸收水平的增加轉移[1]。骨質(zhì)疏松癥影響著全世界大約2億人，其防治仍然是一項艱難的挑戰(zhàn)，需要我們?nèi)ミM一步研究和探索新的預防策略和更有效的治療方式[2]。骨質(zhì)疏松模型的建立是研究骨質(zhì)疏松發(fā)病機制，合理地選擇動物模型對實驗的結果起著至關重要的作用，是用藥干預治療防御的基礎[3]。卵巢摘除法由于操作簡單，造模易成功，實驗可重復性高，已成為骨質(zhì)疏松癥常用的動物造模方法，C57BL/6種屬的小鼠由于其遺傳信息明確，耐受性高，而且消耗的成本比大鼠少，造模周期短，因此選擇C57BL/6雌性小鼠作為實驗研究的基礎媒介[4]。本研究的目的是通過制備去卵巢小鼠骨質(zhì)疏松模型，建立一種模擬人體病理的骨質(zhì)疏松癥。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 雌性C57BL/6小鼠，10～12周齡，體重20～25 g，購于長沙市天勤生物技術有限公司[SCXK(湘)2019-0014]；冰凍切片機Leica CM1950(2019175001，德國)；SAKURA櫻花冷凍包埋盒(Surgipath FSC 22 Blue Frozen Section Compound Leica Biosystems Melbourne Pty Ltd-ABN)；Cryofilm type ⅡC(9)SECTION-LAB Co.Ltd.，Japan；TRAP/ALP染色試劑盒(294-67001，F(xiàn)UJIFILM WAKO)；蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(C0105，碧云天)；熒光倒置顯微鏡(2015236500，Leica DMI3000B)，Micro CT掃描儀(QuantumGX2，PerkinElmer)。

1.2 實驗動物 本研究選取了10只雌性C57BL/6小鼠，10～12周齡，體重20～25 g。所有的動物實驗均完全遵守相關倫理審批要求，實驗動物飼養(yǎng)流程均嚴格遵守實驗室動物的飼養(yǎng)規(guī)程和使用指南。實驗前，所有購買的小鼠均于右江民族醫(yī)學院動物實驗中心檢疫室飼養(yǎng)7 d適應環(huán)境，然后轉移至SPF級實驗室，每天觀察小鼠狀態(tài)。每個籠子飼養(yǎng)5只，不限水，標準飲食，室溫維持在24～26℃，濕度為55%～60%，光照時間適宜，實驗過程中小鼠也是繼續(xù)飼養(yǎng)于SPF級實驗室。

1.3 實驗分組 10只雌性C57BL/6小鼠隨機分組，分別為卵巢摘除骨質(zhì)疏松模型(OVX)組和假手術(Sham)組，飼養(yǎng)環(huán)境和條件均保持一致。術后8周取10只小鼠的左邊股骨均進行Micro CT檢測，右邊股骨用包埋劑包埋，-80℃冰箱保存，由于骨組織較硬，未進行脫鈣，因此我們使用SECTION-LAB Co.Ltd切片裝置，將其黏附在骨組織包埋塊表面，使骨組織轉移至該切片裝置上，然后使用冰凍切片機進行冰凍切片，厚度為6 μm，行HE染色、TRAP染色、ALP染色、免疫熒光染色。

1.4 卵巢摘除術 將已分組的10只C57BL/6雌性小鼠，75%酒精消毒注射部位后，水合氯醛(4%，5 ml/kg，腹腔注射)進行麻醉，待其行動遲鈍后，背部備皮，消毒手術部位，從背部腎區(qū)附近雙側分別作一縱行切口，切開筋膜分離肌肉及腹膜，找到附著于脂肪組織上的粉紅色卵巢組織，完整摘除兩側卵巢組織，剩下Sham組5只小鼠，則切除卵巢旁小塊脂肪組織，手術針線層層縫合，慶大霉素消毒。術后3 d也連續(xù)用慶大霉素涂抹傷口，以防手術感染，摘除的卵巢塊經(jīng)冰凍切片(6 μm)，蘇木精伊紅(HE)染色法鏡下鑒定為卵巢組織。

1.5 外周血生物化學學檢測 麻醉小鼠后，眼球取血檢測血鈣(Ca)、磷(P)、鎂(Mg)、堿性磷酸酶(ALP)水平等，于右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院檢驗科檢驗，采用分光光度法檢測。

1.6 顯微斷層掃描技術(Micro CT) 分別取OVX組和Sham組小鼠的股骨標本剔除干凈周邊軟組織，放置于4%多聚甲醛中浸泡24 h后進行Micro CT掃描，電壓90 kV；電流80 μA，掃描方式360°旋轉，成像視野9 mm×9 mm×9 mm，高分辨率模式分辨率18 μm，掃描時間14 min，掃描完畢后使用系統(tǒng)自帶的三維重建軟件對所掃描的圖片進行重建，得到三維Micro CT數(shù)據(jù)。

1.7 組織病理學檢查 自-80℃低溫冰箱取出OVX組和Sham組小鼠股骨頭的冰凍切片，將切片置于常溫10～15 min回溫至37℃，自然晾干，-20℃甲醇固定10 min，1×PBS緩沖液清洗，依次滴加蘇木素1 min，流水沖洗，伊紅染液覆蓋標本30 s，70%、80%、90%、100%乙醇依次脫水，二甲苯透明，晾干后中性樹膠封片，鏡下觀察。

1.8 組織化學染色 取OVX組和Sham組小鼠股骨頭冰凍切片行抗酒石酸酸性磷酸酶染色(TRAP染色)以及堿性磷酸酶染色(ALP染色)。將切片置于常溫10～15 min回溫37℃自然晾干，-20℃甲醇固定10 min，流水清洗，滴加適量的按比例配制的TRAP染色液覆蓋標本，常溫放置30 min(酒石酸溶液∶酸性磷酸酶底物溶液A∶酸性磷酸酶底物溶液B為1∶9∶0.1配置混勻)，PBS清洗，二甲苯透明，中性樹膠封片。骨組織切片固定水洗后進行ALP染色，滴加0.1 mol AMPD-HCL緩沖液覆蓋組織標本，10 min，滴加適量的堿性磷酸酶預混物溶液，室溫保濕盒孵育30 min，然后水洗，核染色試劑覆蓋組織5 s，水洗后二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.9 免疫熒光染色 取OVX組和Sham組小鼠股骨頭冰凍切片行免疫熒光染色。切片置于常溫10～15 min回溫37℃自然晾干，-20℃甲醇固定10 min。1xPBS緩沖液清洗2～3次，每次5 min，滴加PBS/1%BSA封閉液，保濕盒常溫放置40 min，4℃孵育一抗抗酒石酸酸性磷酸酶(以1∶1000的比例稀釋)過夜，DAPI(1 h)染色細胞核，免疫熒光倒置顯微鏡觀察組織。

2 結果

2.1 外周血生物化學檢測 行雙側卵巢切除術8周后，經(jīng)血清學檢測，OVX組與Sham組的鈣、磷、鎂含量變化不大，Sham組的ALP含量比OVX組的含量高(P<0.001)，見表1。

2.2 Micro CT檢查 小鼠在卵巢摘除術后8周，股骨經(jīng)Micro CT掃描三維重建后，與Sham組相比，無論是從橫斷面還是縱切面來看，OVX組的骨小梁數(shù)量減少，排列稀疏，間隔大，分離度也增加，見圖1。

表1 雙側卵巢切除術后8周小鼠生化指標變化

注：A：Sham組(縱切面)；B：OVX組(縱切面)；C：Sham組(橫切面)；D：OVX組(橫切面)。

2.3 組織病理學檢查 小鼠術后8周，股骨組織HE染色結果顯示，Sham組骨小梁致密、完整、連續(xù)；OVX組骨小梁紊亂，出現(xiàn)斷裂(見圖2A、圖2B)。破骨細胞(細胞核>2)計數(shù)，單位面積內(nèi)Sham組的破骨細胞總數(shù)比OVX組的少(P<0.01)；在相同的視野下也發(fā)現(xiàn)OVX組破骨細胞的數(shù)目明顯多于Sham組(P<0.01)，差異具有統(tǒng)計學意義，見圖2C、圖2D，表2。

注：A：Sham組；B：OVX組；C：Sham組；D：OVX組。

表2 術后8周骨組織切片破骨細胞計數(shù)

2.4 TRAP染色和ALP染色 小鼠骨組織TRAP染色，TRAP的活性部位呈紅紫色；ALP染色，ALP的活性部位呈藍色(茶褐色)。ALP和TRAP染色顯示，與Sham組相比，OVX組ALP酶分泌減少，但差異不明顯；而TRAP酶的分泌增多，紫紅色區(qū)域更深，分布面積更廣。

注：TRAP染色，A：Sham組，B：OVX組；ALP染色，C：Sham組，D：OVX組。

2.5 免疫熒光檢測結果 熒光倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)OVX組的骨組織上TRAP蛋白(綠色熒光)的表達增多，見圖4。

注：A～C：Sham組；D～F：OVX組。

3 討論

隨著人口老齡化的增加，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥已成為全球性的公共衛(wèi)生問題。雌激素和孕激素可以影響骨的生長，雌激素的缺乏引發(fā)了骨質(zhì)流失的快速階段，增加絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松婦女患骨質(zhì)疏松的風險，影響骨代謝的平衡[5]，其水平降低，可顯著增加破骨細胞的活性，加速骨吸收，使骨形成不足[6]。在老化的骨骼中，雌激素減少會導致過量的破骨細胞(OC)介導的骨組織吸收，從而導致正常骨代謝失衡，在這一失衡過程中，由單核巨噬細胞分化而來的破骨細胞是唯一具有骨吸收生物學活性的細胞系[7]。因此，破骨細胞在生理和病理性的骨吸收中發(fā)揮核心作用，從而導致包括絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生。

本研究的實驗目的是驗證評定雙側卵巢切除后的C57BL/6小鼠是否形成骨質(zhì)疏松狀態(tài)，以便考究是否可以進行下一步的藥物治療骨質(zhì)疏松癥的活體實驗。由于大鼠的骨代謝周期久，造模時間長，用藥多，耗資大，因此我們選擇10～12周齡、成熟的、骨代謝水平趨于穩(wěn)定的C57BL/6雌性小鼠行雙側卵巢摘除法以建立骨質(zhì)疏松癥模型[8]?，F(xiàn)今也有很多其他的造模方法，如維甲酸、鏈脲佐菌素誘導方法等。但是由于卵巢切除法簡單易行，成本小，不易感染，造模成功率高，如今成為了FDA和WHO公認的研究絕經(jīng)后雌激素缺乏型骨質(zhì)疏松癥的最佳模型[9]。骨質(zhì)疏松模型的鑒定方法也多種多樣，從血清學骨代謝生化指標、病理組織形態(tài)學分析、骨組織計量方法等均能闡述骨組織的改變情況。傳統(tǒng)的骨質(zhì)疏松模型鑒定方法單一，我們通過綜合多種檢測方法客觀評定骨質(zhì)疏松模型的成功與否，以便進行下一步的小鼠體內(nèi)藥物干預實驗。

既往的研究發(fā)現(xiàn)[10]，由于小鼠體積較小，使用雙能X線骨密度儀(dual energyX-ray absorptiometry，DEXA)測量小鼠的骨密度存在較大誤差，結果的準確性不高；而Micro CT的分辨率可達微米級別，對骨組織的微結構可進行精確的測量，其測量參數(shù)的一致性和可重復性更高[8]，更適合用于評估小鼠的骨微結構的改變以及骨質(zhì)疏松模型，能更早、更真實地反映出老年骨組織結構的改變情況[11]。本研究的結果也發(fā)現(xiàn)小鼠股骨遠端行Micro CT掃描重建后發(fā)現(xiàn)骨小梁的數(shù)目以及結構發(fā)生明顯改變，而骨組織切片HE染色形態(tài)學觀察也證實了符合骨質(zhì)疏松的病理改變情況，初步驗證了骨質(zhì)疏松模型建立成功。

TRAP是顯示骨吸收以及破骨細胞活性的良好標志物，可以比較直觀地反映出機體的骨代謝情況，觀察破骨細胞的分化程度；而ALP是反映成骨形成的重要標志物。TRAP染色結果顯示TRAP酶的顏色以及分布面積增加，提示OVX組破骨細胞比Sham組的更加活躍；免疫熒光染色的結果也證實了這一結果；而ALP則相反，卵巢摘除后成骨細胞的活性及數(shù)目均降低。從血清生化指標檢測以及病理組織切片HE、TRAP、ALP染色、免疫熒光結果分析均反映了骨形成活性降低，成骨細胞凋亡，破骨細胞與成骨細胞的動態(tài)失衡導致骨細胞功能的喪失，骨組織微結構之間的空隙增加，骨質(zhì)疏松加劇，進一步證實了上述結果的可信。

骨小梁結構和數(shù)目的改變，血清生化檢測指標的變化以及病理組織染色反映了骨組織結構發(fā)生較大的改變，證實了雙側卵巢摘除法使小鼠發(fā)生骨質(zhì)疏松模型很成功，可以進行后期小鼠體內(nèi)藥物的干預實驗，以期為骨質(zhì)疏松提供合理、有效的治療策略。