皮肌炎患者Th17細胞及其相關細胞因子的表達變化與意義

吳遠慧，陳雷剛，楊亞慧，楊曉靜，黃攀登，馮冬梅，楊金良，周向昭

河北北方學院附屬第一醫院，河北張家口075000

皮肌炎是一種以肌肉無力為特點的自身免疫性疾病，主要累及橫紋肌，可伴或不伴多種皮膚損害，亦可伴發各種內臟損害［1］。皮肌炎作為自身免疫性疾病，其發病與機體免疫系統調節失衡密切相關，而T 淋巴細胞介導的細胞免疫反應是機體重要的免疫調節機制［2-3］。輔助性T 細胞17（Th17）是在白細胞介素23（IL-23）誘導下由CD4+T 細胞的Th 細胞亞群合成和分泌的T 細胞亞群，可通過激活T 淋巴細胞、中性粒細胞等炎性細胞而釋放IL-17、IL-23 等細胞因子［4］。關于上述相關細胞因子在皮肌炎發病過程中的作用，目前相關研究證據尚不足。本研究主要探討皮肌炎患者Th17 細胞及其相關細胞因子的表達變化與意義，為皮肌炎臨床診斷及治療提供指導。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2016 年6 月—2020 年6 月本院皮膚科收治的皮肌炎患者68例，均符合皮肌炎的診斷標準［7］：①患者皮膚出現明顯皮疹；②肌肉活動可見肌肉呈病變性壞死；③肢帶肌及頸前屈肌無力且伴有吞咽困難或呼吸肌無力；④實驗室檢驗發現C 反應蛋白（CRP）、紅細胞沉降率（ESR）、鐵蛋白（FER）、肌酸激酶（CK）、乳酸脫氫酶（LDH）異常升高；⑤肌電圖顯示有肌源性損害。納入標準：①年齡18～75 歲；②簽署知情同意書；③未接受免疫抑制劑、糖皮質激素類藥物治療。排除標準：①惡性腫瘤；②可能影響本研究結果的其他急、慢性炎癥反應性疾病；③合并其他自身免疫性疾病，如系統性紅斑狼瘡；④妊娠期或哺乳期。其中男38例，女30例；年齡22～67（42.5 ± 3.8）歲。于同期隨機選取體檢健康者60例為對照組，近3個月內均無外傷史、無手術史、未服用藥物。其中男34 例，女26 例；年齡18～72（43.2 ± 3.9）歲。兩組性別、年齡比較差異無統計學意義（P 均＞0.05），具有可比性。本研究獲得醫院醫學倫理委員會批準。

1.2 血清IL-17、IL-22、IL-23 及相關實驗室指標檢測 抽取兩組清晨空腹肘靜脈血5 mL，常溫下靜置30 min，3 000 r/min 離心10 min，離心半徑10 cm，留取上清液，于-80 ℃冰箱中保存，留待檢測。采用酶聯免疫吸附法測定血清IL-17、IL-22、IL-23、CRP。IL-17、IL-22、CRP 試劑盒均由上海西唐生物科技有限公司提供，IL-23試劑盒由北京和杰創新生物醫學科技有限公司提供，嚴格按照試劑盒說明進行操作。用貝克曼庫爾特AU5800 全自動生化分析儀檢測紅細胞沉降率（ESR）、鐵蛋白（FER）、肌酸激酶（CK）、乳酸脫氫酶（LDH）。

1.3 外周血Th17細胞檢測 采用流式細胞術。抽取兩組清晨空腹肘靜脈血3 mL，置于EDTA-K2抗凝真空管，用Ficoll 淋巴細胞分離液分離獲得外周血單個核細胞。用RPMI1640 稀釋全血，加入佛波醇乙酯25 μL、離子霉素20 μL、布雷菲德霉素A 4 μL，37 ℃孵育5 h。設A 管（同型對照管）和B 管（檢測管），每管分別加入CD3-PerCP 2.5 μL、CD8-FITC 2.5 μL，室溫避光孵育15 min，加入破膜劑中的Re?agent A 100 μL，室溫避光15 min。清洗后每管加入Reagent B 100 μL。分別向A、B 管加入鼠IgG1-PE、IL-17-PE 2.5 μL，室溫避光15 min，清洗后加500 μL PBS 重懸，上機檢測，計算CD4+Foxp3+調節性T 細胞/CD4+T細胞、CD4+IL-17+/CD4+T細胞。

1.4 疾病活動度評價 參考文獻［8］方法，采用肌炎疾病活動性評估視覺模擬量表（MYOACT）進行評價，包括一般情況、肌肉、心臟、肺臟、骨骼肌、胃腸道、皮膚黏膜等7 個系統及1 個疾病總活動評分，對應評分為0～4 分，MYOACT-總活動度評分為0～28分，分值越高提示患者疾病活動性越高。

1.5 統計學方法 采用SPSS21.0 統計軟件。計量資料采用±s表示，組間計量資料比較采用成組t檢驗，皮肌炎患者外周血Th17細胞及其相關細胞因子與MYOACT 及相關臨床指標的關系采用Pearson積矩相關分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組外周血調節性T 細胞/Th17 細胞百分率比較 見表1。

表1 兩組外周血調節性T細胞/Th17細胞百分率及相關細胞因子比較（ ± s）

表1 兩組外周血調節性T細胞/Th17細胞百分率及相關細胞因子比較（ ± s）

注：與對照組相比，*P＜0.05。

組別皮肌炎組對照組IL-23（pg/mL）51.42±4.02*20.11±4.69 n 68 60 CD4+Foxp3+調節性T細胞/CD4+T細胞7.21±0.31*9.92±0.54 CD4+IL-17+/CD4+T細胞1.35±0.32*0.81±0.21 IL-17（pg/mL）77.25±6.14*28.96±5.02 IL-22（pg/mL）48.12±5.88*22.11±4.11

2.2 皮肌炎組與對照組MYOACT 活動度評分、CRP、ESR、FER、CK、LDH比較 見表2。

表2 皮肌炎組與對照組CRP、ESR、FER、CK、LDH比較（ ± s）

表2 皮肌炎組與對照組CRP、ESR、FER、CK、LDH比較（ ± s）

注：與對照組相比，*P＜0.05。

組別皮肌炎組對照組LDH（U/L）402.52±38.52*157.25±10.55 n 68 60 CRP（mg/L）12.25±1.52*2.36±1.41 ESR（mm/h）36.58±3.98*6.71±1.11 FER（mg/mL）345.52±45.85*189.44±21.11 CK（U/L）378.52±46.98*45.88± 5.98

2.3 不同MYOACT 活動度評分亞組外周血調節性T 細胞/Th17 細胞百分率及相關細胞因子比較 皮肌炎組MYOACT 活動度評分為（7.62±1.55）分，按照MYOACT 活動度評分中位數7 分為界將皮肌炎組患者分為兩個亞組，MYOACT 活動度評分＞7分者患者CD4+Foxp3+調節性T細胞/CD4+T細胞百分率低于≤7 分者，CD4+IL-17+/CD4+T 細胞百分率高于≤7 分者（P 均＜0.05）；MYOACT 活動度評分＞7 分者血清IL-17、IL-22、IL-23 水平均高于≤7 分者（P 均＜0.05），見表3。

表3 不同MYOACT 活動度評分亞組外周血調節性T細胞/Th17細胞百分率及相關細胞因子比較（ ± s）

表3 不同MYOACT 活動度評分亞組外周血調節性T細胞/Th17細胞百分率及相關細胞因子比較（ ± s）

注：與MYOACT活動度評分＞7分者相比，*P＜0.05。

研究對象MYOACT活動度評分≤7分者MYOACT活動度評分＞7分者IL-23（pg/mL）40.79±5.33*59.42±5.18 n 37 31 CD4+Foxp3+調節性T細胞/CD4+T細胞百分率8.56±1.24*5.38±1.12 CD4+IL-17+/CD4+T細胞百分率1.04±0.49*1.92±0.57 IL-17（pg/mL）43.89±8.15*85.60±8.47 IL-22（pg/mL）37.56±6.01*51.68±5.59

2.4 皮肌炎患者疾病活動度及臨床指標與Th17細胞及其相關細胞因子的關系 Pearson 積矩相關性分析結果示，皮肌炎患者外周血CD4+Foxp3+調節性T 細胞/ CD4+T 細胞百分率與MYOACT 總活動度評分、CRP、ESR、FER、CK、LDH 呈負相關（r 分別為-0.741、-0.698、-0.587、-0.772、-0.682、-0.655，P 均＜0.05），CD4+IL-17+/CD4+T 細胞百分率與MYO?ACT 活動度評分、CRP、ESR、FER、CK、LDH 呈正相關（r 分 別 為0.652、0.712、0.722、0.738、0.736、0.711，P 均＜0.05），IL-17 與MYOACT 活動度評分、CRP、ESR、FER、CK、LDH 呈正相關（r分別為0.662、0.671、0.689、0.692、0.715、0.703，P 均＜0.05），IL-22 與MYOACT 活動度評分、CRP、ESR、FER、CK、LDH 呈 正 相 關（r 分 別 為0.569、0.578、0.662、0.612、0.702、0.682，P 均＜0.05），IL-23 與MYOACT活動度評分、CRP、ESR、FER、CK、LDH 呈正相關（r 分 別 為0.498、0.562、0.485、0.668、0.691、0.775，P均＜0.05）。

3 討論

皮肌炎典型臨床表現有四肢關節伸面出現紫紅色斑疹，對稱性四肢近端肌肉進行性無力、骨骼肌呈現炎性細胞大量聚集浸潤、肌電圖肌源性改變等［9-10］。皮肌炎的發病機制尚未完全明確，可能與遺傳、感染等因素有關，特別是感染所致的免疫調節功能紊亂貫穿皮肌炎發病整個過程［11］。

研究顯示，在炎癥因子刺激下，Th 細胞前體可分化為Th0 細胞，并進一步轉化為調節性T 細胞及Th17 細胞，調節性T 細胞占外周血CD4+T 細胞數的5%～10%，其中Foxp3 是其天然的特異性標志，CD4+Foxp3+調節性T 細胞在IL-6 作用下可誘導生成Th17 細胞，并通過釋放炎性細胞因子而參與自身免疫性疾病發病過程［12］。Th17細胞屬于獨特的CD4+T細胞亞群，主要對抗細胞外細菌以及霉菌的免疫反應，通過分泌IL-17、IL-22 等促炎因子而激活相關免疫細胞，最終導致機體出現自身免疫反應。研究顯示，Th17 與CD4+T 細胞亞群之間存在復雜的網絡調控，在介導炎癥反應及免疫反應功能上相互拮抗，從而發揮抵抗外界感染及誘導自身免疫疾病等功能［13］。IL-17 是在T淋巴細胞誘導下由外周血CD4+Foxp3+調節性T 細胞產生的前炎癥細胞因子，CD4+IL-17+與機體的抗感染及自身免疫調節密切相關，參與風濕性關節炎、系統性紅斑狼瘡等自身免疫病發病過程［14］。IL-22 屬IL-10 家族成員，是Th17 細胞合成并分泌的具有調節天然免疫和促進抗微生物防御等生物學功能的細胞因子。IL-23 是由活化的樹突狀細胞、單核細胞及巨噬細胞等產生的細胞因子，在機體炎性免疫以及體內IL-17產生過程中發揮作用，可促進T 細胞增殖，誘導記憶性T 細胞增殖。研究顯示，細胞因子IL-17、IL-22、IL-23 與微環境中的炎性細胞因子相互作用，可刺激巨噬細胞等炎癥細胞產生TGF-β并介導Th17細胞分化［15］。

本研究結果顯示，皮肌炎患者外周血CD4+Foxp3+調節性T 細胞/ CD4+T 細胞百分率低于對照組，CD4+IL-17+/CD4+T 細胞百分率、IL-17、IL-22、IL-23 高于對照組，提示皮肌炎患者存在明顯的免疫調節異常，其機制可能是Th17 與調節性T 細胞間可相互轉化、相互抑制，Th17 細胞異常增加導致各亞群細胞失調，機體免疫功能紊亂，從而誘發皮肌炎［16］。血清CRP、ESR、FER、CK 是目前臨床輔助診斷皮肌炎的常用指標。本研究結果顯示，皮肌炎組CRP、ESR、FER、CK、LDH 高于對照組，說明皮肌炎的發生與機體炎癥反應及免疫功能異常有關。

研究指出，皮肌炎患者血清CD4+IL-17+/CD4+T細胞百分率升高的患者更易發生肌肉組織壞死［18］。本研究發現，相較MYOACT活動度評分≤7分的皮肌炎患者，MYOACT 活動度評分＞7 分者外周血CD4+Foxp3+調節性T 細胞/ CD4+T細胞百分率更低，CD4+IL-17+/CD4+T 細胞百分率更高，而且炎性因子IL-17、IL-22、IL-23 水平升高。進一步研究結果顯示，皮肌炎患者MYOACT 總活動度評分與外周血CD4+Foxp3+調節性T 細胞/CD4+T 細胞百分率呈負相關，而MYOACT 活動度評分與CD4+IL-17+/CD4+T 細胞百分率、IL-17、IL-22、IL-23 呈正相關。可能是因為炎癥會導致肌肉細胞壞死或凋亡，從而引起T 淋巴細胞轉錄后修飾，而修飾后的T 淋巴細胞會刺激免疫系統產生抗體，因此可通過測定T 淋巴細胞及其相關細胞因子水平評價皮肌炎患者肌組織壞死情況［19］。皮肌炎患者CRP、ESR、FER、CK、LDH 與外周血CD4+Foxp3+調節性T細胞/CD4+T細胞百分率呈負相關，而CRP、ESR、FER、CK、LDH 與CD4+IL-17+/CD4+T 細胞百分率、IL-17、IL-22、IL-23 呈正相關，表明皮肌炎患者病情控制與Th17細胞及其相關因子調控有密切的關系。通過下調Th17細胞及其相關細胞因子表達能有效抑制皮肌炎患者強炎癥反應，從而避免炎癥因子攻擊靶器官，引起患者相關并發癥。

綜上所述，Th17 細胞及其相關細胞因子的表達失衡可能與皮肌炎的發生有關，測定其水平可輔助臨床評估患者病情進展。