術(shù)前血清miR-186-5p 對急性冠脈綜合征患者PCI術(shù)后發(fā)生主要不良心血管事件的預(yù)測價(jià)值

孫經(jīng)超，田曉嵐，胡瑛霞

丹東市中心醫(yī)院，遼寧丹東118000

急性冠脈綜合征（ACS）指冠狀動(dòng)脈發(fā)生粥樣硬化引起的冠脈管腔狹窄、閉塞，進(jìn)而導(dǎo)致心肌缺血缺氧性壞死，是較危險(xiǎn)的冠心病類型，在世界范圍內(nèi)有較高的發(fā)病率和病死率［1-2］。行經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療（PCI）是目前臨床挽救缺血心肌、保護(hù)心功能的首選治療手段［3］。但PCI 術(shù)后患者冠心病危險(xiǎn)因素仍存在，主要不良心臟事件（MACE）發(fā)生率較高。PCI 術(shù)后MACE 的發(fā)生機(jī)制涉及心肌細(xì)胞凋亡和丟失、缺血再灌注損傷、脂質(zhì)代謝紊亂、內(nèi)皮功能受損、動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成等。微小RNA（miRNA）是具有調(diào)控基因表達(dá)功能的內(nèi)源性非編碼RNA，參與心血管疾病發(fā)生發(fā)展［4-5］。現(xiàn)有報(bào)道顯示，miR-186-5p 在乙醇誘導(dǎo)的損傷心肌細(xì)胞中高表達(dá)，發(fā)揮調(diào)控心肌細(xì)胞凋亡作用［6-7］，被認(rèn)為是缺血性心血管疾病早期診斷的潛在生物學(xué)指標(biāo)。本研究擬探討miR-186-5p 與ACS 患者PCI 后發(fā)生MACE 的關(guān)系，旨在為臨床預(yù)后評(píng)估提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2017 年9 月－2019 年2 月我院心內(nèi)科住院部收治的150 例ACS 患者（ACS 組），納入標(biāo)準(zhǔn)：①冠狀動(dòng)脈造影（CAG）檢查至少1 支冠脈狹窄≥50%，符合《急性冠脈綜合征急診快速診療指南》診斷標(biāo)準(zhǔn)［8］；②均行PCI 治療，治療后規(guī)律服藥，保持隨訪；③實(shí)驗(yàn)室、影像學(xué)檢查結(jié)果完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①采用保守治療或行冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)患者；②合并瓣膜病、心肌炎、心包炎等器質(zhì)性心臟病；③穩(wěn)定型心絞痛，心功能不全；④隨訪期間出現(xiàn)腦血管意外、感染、消化道出血等其他并發(fā)癥相關(guān)死亡病例。其中男89 例，女61 例；年齡59～73 歲。另選擇年齡、性別相匹配的103 例門診體檢健康者為對照組，均排除心血管疾病，男69 例，女34 例，年齡60～79 歲。兩組性別、年齡資料比較具有可比性（P均＞0.05），本研究獲得我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者或其家屬知情同意并簽署同意書。

1.2 血清miR-186-5p 表達(dá)檢測 所有ACS 患者術(shù)前及術(shù)后1、2、3、7 d（對照組于體檢當(dāng)日）采集肘靜脈血3 mL，注入EDTA 抗凝管混勻，4 ℃、2 000 r/min離心10 min（離心半徑15 cm），取上層血清于EP 管置于-80 ℃超低溫冰箱保存。取血清樣本加入TRIzol（美國Invitrogen 公司）充分混勻，提取總RNA，ND-1000 紫外分光光度計(jì)（NanoDrop 公司）檢測RNA 純度和完整性，選擇吸光度值A(chǔ)260/A280RNA樣品，M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶（Epicentre 公司）按照試劑盒說明將其轉(zhuǎn)錄為cDNA。CFX96 實(shí)時(shí)熒光PCR 儀（美國Bio-Rad）檢測血清中miR-186-5p表達(dá)，引物合成及序列測定由上海基康生物技術(shù)公司完成。miR-186-5p 正向引物：5′-GCGCTAAGGCACGCGGT-3′，反向引物：5′-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′。以U6為內(nèi)參，U6 正向引物5′-CTCGCTTCG GCAGCACA-3′，反向引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。qRT-PCR 流程：將cDNA 樣品分別加入qRT-PCR 反應(yīng)體系（共20 μL，其中上下引物各1 μL）。反應(yīng)條件：95 ℃變性10 s，65 ℃退火20 s；75 ℃延伸15 s，共40 個(gè)循環(huán)。以U6 snRNA 為內(nèi)參，2-ΔΔCt計(jì)算miR-186-5p 相對表達(dá)量，共做3 次平行試驗(yàn)，取平均值。ΔΔCt miR-186-5p=ΔCt miR-186-5p-ΔCt U6 snRNA。

1.3 觀察指標(biāo) 收集所有受試者社會(huì)人口學(xué)資料（性別、年齡、煙酒嗜好、家族遺傳史）、基礎(chǔ)疾病（高血病、糖尿病、高脂血癥）、冠脈造影結(jié)果（冠脈狹窄程度、冠脈病變長度、術(shù)前Gensini 評(píng)分）、超聲心動(dòng)圖結(jié)果［美國GE Vivid E9 心臟超聲診斷儀（三維矩陣探頭頻率1.5～3.5 MHz）測量舒張末期左心室內(nèi)徑（LVEDD）、收縮末期左心室內(nèi)徑（LVESD）、左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）］、其他實(shí)驗(yàn)室生化指標(biāo)［西門子ADVIA 2120 全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀檢測白細(xì)胞（WBC）、血小板（PLT）水平，強(qiáng)生血糖儀測定空腹血糖（FPG），羅氏Modular全自動(dòng)生化分析儀檢測總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C），F(xiàn)IA8000免疫定量分析儀應(yīng)用放射免疫法檢測血清肌酸激酶（CK）及其同工酶（CK-MB）、N末端B型利鈉肽原（NT-proBNP）水平，試劑盒購自四川邁克生物科技有限公司］。

1.4 隨訪 ACS 患者出院后隨訪12 個(gè)月，采用門診或電話形式隨訪，每月1 次。統(tǒng)計(jì)隨訪期間MACE 發(fā)病情況，MACE 定義［7］：再次心肌梗死、血運(yùn)重建、心力衰竭、心源性死亡。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS25.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。繪制受試者工作特征（ROC）曲線分析miR-186-5p 對ACS 患者PCI 術(shù)后MACE 的預(yù)測價(jià)值。Kaplan-Meier 生存分析不同miR-186-5p表達(dá)ACS 患者PCI 術(shù)后MACE 發(fā)生率，Log-Rank 檢驗(yàn)組間差異。Cox 風(fēng)險(xiǎn)回歸分析影響ACS 患者PCI術(shù)后發(fā)生MACE 的危險(xiǎn)因素。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ACS 患者血清miR-186-5p 表達(dá)及MACE 發(fā)生情況 ACS 組術(shù)前及術(shù)后1、2、3、7 d 血清miR-186-5p 相對表達(dá)量分別為0.42 ± 0.12、0.32 ± 0.11、0.21 ± 0.09、0.21 ± 0.08、0.21 ± 0.07，對照組為0.20±0.06。ACS組術(shù)前、術(shù)后1 d血清miR-186-5p表達(dá)高于對照組（P 均＜0.05），術(shù)后2、3、7 d 血清miR-186-5p表達(dá)與對照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均＞0.05）。術(shù)前血清miR-186-5p 表達(dá)高于術(shù)后1、2、3、7 d（P 均＜0.05），術(shù)后1 d 血清miR-186-5p 表達(dá)高于術(shù)后2、3、7 d（P 均＜0.05），術(shù)后2、3、7 d 血清miR-186-5p 表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均＞0.05）。本組150 例ACS 患者PCI 術(shù)后12 個(gè)月發(fā)生MACE 共35 例（23.33%），其中再次性心肌梗死14例（40.00%），再次血運(yùn)重建7 例（20.00%）、心力衰竭10 例（28.57%），心源性死亡4 例（11.43%），未發(fā)生MACE 共115 例。ROC 曲線分析術(shù)前血清miR-186-5p 表達(dá)預(yù)測ACS 患者PCI 術(shù)后發(fā)生MACE 的最佳截?cái)嘀禐?.045（靈敏度為82.86%，特異度為88.70%），曲線下面積為（AUC）為0.878（95%CI：0.808～0.948，P＜0.05），高 于 術(shù) 后1 d 的0.711（95%CI：0.605～0.816，P＜0.05），二者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=2.316，P＜0.05）。術(shù)后2、3、7 d 血清miR-186-5p 不具備診斷效能（AUC 分別為0.570、0.502、0.446，P均＞0.05）。

2.2 不同miR-186-5p 表達(dá)ACS 患者預(yù)后比較 根據(jù)術(shù)前miR-186-5p 預(yù)測ACS 患者PCI 術(shù)后發(fā)生MACE 的最佳截?cái)嘀祵⒒颊叻譃閙iR-186-5p高表達(dá)組82 例（miR-186-5p≥0.045）和miR-186-5p 低表達(dá)組68例（miR-186-5p＜0.045），Kaplan-Meier生存曲線分析示miR-186-5p高表達(dá)組MACE發(fā)生率為31.71%（26/82），高于miR-186-5p低表達(dá)組的14.71%（10/68）（χ2=6.424，P=0.011）。

2.3 MACE 組和非MACE 組基線資料和臨床指標(biāo)比較 MACE 組和非MACE 組年齡、性別、吸煙史、飲酒史、合并高血壓史、合并糖尿病史、TG、TC、FPG、LVESD、LVEDD 比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均＞0.05）。MACE 組LVEF 低于非MACE 組（P＜0.05），CK、CK-MB、NT-proBNP、冠脈病變長度、冠脈狹窄率、術(shù)前Gensini 評(píng)分高于非MACE 組（P 均＜0.05），見表1。

2.4 影響ACS 患者PCI 術(shù)后發(fā)生MACE 的因素分析 多因素Cox 風(fēng)險(xiǎn)回歸分析示高術(shù)前Gensini 評(píng)分、術(shù)前miR-186-5p 表達(dá)是ACS 患者PCI 術(shù)后發(fā)生MACE的危險(xiǎn)因素（P均＜0.01），見表2。

表1 MACE和非MACE患者基線資料比較

表2 ACS患者PCI術(shù)后發(fā)生MACE的多因素Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸分析

3 討論

PCI 血運(yùn)重建可開通梗死冠脈，恢復(fù)血流供應(yīng)，但是同時(shí)可導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂、形成新的血栓，導(dǎo)致冠脈再狹窄、再次心肌梗死等MACE事件發(fā)生，影響患者預(yù)后［9-10］。早期預(yù)測MACE 有助于合理制定臨床治療方案，降低患者病死率，延長患者生存時(shí)間。目前缺乏有效的MACE 預(yù)測機(jī)制，量表評(píng)估存在一定主觀性，受評(píng)估者經(jīng)驗(yàn)等主觀因素影響較大，且缺乏影像學(xué)檢查結(jié)果以及與患者預(yù)后密切相關(guān)的生物學(xué)指標(biāo)，存在一定局限性。與心肌損傷相關(guān)的標(biāo)志物，如肌酸激酶同工酶、C 反應(yīng)蛋白、肌紅蛋白等敏感度偏低。miRNA 是一類由20～25 個(gè)核苷酸組成的非編碼單鏈RNA，參與細(xì)胞分化增殖、凋亡等多種病理生理過程，目前報(bào)道顯示在高血壓、心律失常、ACS等多種心血管疾病中均有特定循環(huán)miRNA 表達(dá)，其中超過50 種miRNA 在ACS 診斷方面具有較大臨床價(jià)值［11］。

miR-186-5p 是miR-186 家族成員之一，具有調(diào)控細(xì)胞增殖、生長分化、遷移、平滑肌分化和收縮等作用，miR-186-5p表達(dá)異常，調(diào)控機(jī)制失衡與多種生理和病理過程相關(guān)［12-13］。miR-186-5p 在多種腫瘤中被發(fā)現(xiàn)具有癌基因和抑癌基因雙重作用，在骨肉瘤細(xì)胞中miR-186-5p 表達(dá)下調(diào)，miR-186-5p 直接靶向叉頭盒K1（FOXK1）3′-UTR 并負(fù)調(diào)控其表達(dá)，在腫瘤細(xì)胞增殖、腫瘤生長、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用［14］。相反，miR-186-5p 在肺腺癌中呈高度表達(dá)，miR-186-5p直接靶向磷酸酶和tensin同源物（PTEN）促使肺腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲［15］。缺血腦卒中患者血清miR-186-5p 表達(dá)上調(diào)，miR-186-5p 高表達(dá)抑制神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的關(guān)鍵因子胰島素樣生長因子-1 表達(dá)，誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡［16］。JIANG 等［17］報(bào)道指出miR-186-5p 在高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞表達(dá)下調(diào)，而給予miR-186-5p抑制劑可促使Caspase-3表達(dá)，降低心肌細(xì)胞生存能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，說明miR-186-5p在高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷過程中發(fā)揮保護(hù)作用。目前miR-186-5p 在ACS 的相關(guān)報(bào)道較少，其在ACS發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制尚不清楚。

本研究發(fā)現(xiàn)，ACS組術(shù)前miR-186-5p表達(dá)上調(diào)，高于對照組，SUN等［18］發(fā)現(xiàn)，動(dòng)脈粥樣硬化患者血清miR-186-5p 表達(dá)增高，且miR-186-5p 表達(dá)與頸總動(dòng)脈內(nèi)—中膜厚度呈正相關(guān)。說明miR-186-5p 參與動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程和ACS 發(fā)病。PCI 術(shù)后miR-186-5p 表達(dá)逐漸下調(diào)，呈時(shí)間依賴性降低，至術(shù)后2～7 d降至與對照組水平接近。通過隨訪發(fā)現(xiàn)，術(shù)前miR-186-5p 表達(dá)與ACS 患者M(jìn)ACE 有關(guān)，ROC 曲線分析術(shù)前miR-186-5p 表達(dá)在MACE 診斷中效能最高，AUC 達(dá)0.878，高于術(shù)后1～7 d，說明miR-186-5p 對ACS 患者PCI術(shù)后12個(gè)月內(nèi)MACE 的發(fā)生具有較高預(yù)測價(jià)值，可作為PCI 治療預(yù)后的預(yù)測因子。Ka?plan-Meier 生存分析顯示，miR-186-5p 高表達(dá)組MACE發(fā)生率高于miR-186-5p低表達(dá)組，多因素Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸分析結(jié)果表明，PCI 術(shù)前miR-186-5p 表達(dá)過高是導(dǎo)致ACS 患者M(jìn)ACE 的主要原因之一，驗(yàn)證了miR-186-5p 與ACS 患者術(shù)后MACE 的關(guān)系，但具體機(jī)制尚不清楚。可能機(jī)制：①血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙與心血管疾病發(fā)病密切相關(guān)，miR-186-5p 參與細(xì)胞損傷的調(diào)控，Y-linked 15 靶向miR-186-5p 調(diào)節(jié)缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，在缺氧誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷中miR-186-5p 表達(dá)上調(diào)可減輕缺氧誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷［19］。②動(dòng)脈粥樣硬化是ACS 等心血管疾病的主要病理基礎(chǔ)，miR-186-5p 是動(dòng)脈粥樣硬化的生物標(biāo)志物，通過多種途徑參與動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程。miR-186-5p 可通過PTEN/PI3K/Akt 通路調(diào)節(jié)氧化低密度脂蛋白參與動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程［20］，過表達(dá)miR-186-5p 可促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖遷移，誘導(dǎo)和促使動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程［18］。miR-186-5p還可通過E2F1/SNHG7/miR-186-5p/MMP2 軸調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移參與動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程［21］。總之，miR-186-5p 過表達(dá)加劇了冠脈粥樣硬化進(jìn)程，導(dǎo)致血栓形成和MACE事件發(fā)生。

本研究回歸分析結(jié)果顯示，術(shù)前Gensini評(píng)分是ACS 術(shù)后MACE 發(fā)生的危險(xiǎn)因素之一，Gensini 評(píng)分是定量評(píng)估冠脈狹窄程度的指標(biāo)，可全面反映冠脈病變累及范圍和程度，是急性冠脈綜合征患者發(fā)病后1～6個(gè)月MACE風(fēng)險(xiǎn)的獨(dú)立預(yù)測因子［22］。

綜上所述，ACS 患者PCI 術(shù)前miR-186-5p 呈高表達(dá)，miR-186-5p高表達(dá)與MACE 發(fā)生密切相關(guān)，可以為ACS患者預(yù)后評(píng)估提供參考。