伊曲康唑?qū)η傲邢侔┘?xì)胞增殖與遷移的影響

畢菡，于濤，孫希瑞，王曉麗，孫秀梅

1 濰坊醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，山東濰坊261000；2 濰坊醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院

前列腺癌是男性泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤［1］。隨著人口老齡化、吸煙、生活習(xí)慣的改變以及診斷水平進(jìn)步，前列腺癌的發(fā)病率逐年上升［2］。目前，前列腺癌主要以手術(shù)、化療、放療、內(nèi)分泌治療等治療方式為主，雄激素剝奪治療（ADT）是前列腺癌治療的基石，但多數(shù)患者會出現(xiàn)耐藥并發(fā)展為轉(zhuǎn)移性去勢抵抗性前列腺癌（mCRPC），生存率較低［3］。伊曲康唑是一種廣泛應(yīng)用于臨床的抗真菌藥物［4］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，伊曲康唑能抑制胰腺癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、基底細(xì)胞癌等惡性腫瘤的進(jìn)展［5］，但其對前列腺癌細(xì)胞增殖與遷移的具體影響及機(jī)制尚不清楚。2019 年10 月—2020 年10 月，我們通過實(shí)驗(yàn)研究了伊曲康唑?qū)η傲邢侔┘?xì)胞增殖與遷移的影響，并利用生物信息學(xué)聯(lián)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)挖掘了相關(guān)作用的潛在分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人前列腺癌細(xì)胞PC-3 購于上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司。伊曲康唑（I8250）、MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒（M1020）、二甲基亞砜DMSO（D8375）、青霉素、鏈霉素、D-PBS 緩沖液（D1040-500）和胰蛋白酶（T1360）購于北京索萊寶生物科技有限公司；F-12K 培養(yǎng)基及滅活胎牛血清購于美國ATCC公司。

1.2 PC-3 細(xì)胞培養(yǎng) 使用F-12k 培養(yǎng)基，配制胎牛血清為體積分?jǐn)?shù)10%，青霉素100 U/mL、鏈霉素100 μg/mL 的完全培養(yǎng)基。在細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)接種PC-3細(xì)胞，在37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.3 伊曲康唑溶液的配制與保存 稱取250 mg 伊曲康唑溶于17.7 mL DMSO 溶液中，配成20 mmol/L的伊曲康唑存儲液，再用培養(yǎng)基將存儲液稀釋40倍，配成500 μmol/L 的伊曲康唑稀釋液。將DMSO溶于完全培養(yǎng)基，配制濃度為2.5%的DMSO 稀釋液。使用伊曲康唑稀釋液、DMSO 稀釋液、培養(yǎng)基配制成DMSO 濃度為2.5%、伊曲康唑濃度分別為25、50、100、200、400 μmol/L的伊曲康唑工作液。

1.4 細(xì)胞增殖能力檢測 采用MTT 法。取對數(shù)生長期的PC-3 細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基配成細(xì)胞懸液后接種于96 孔板，每孔加入200 μL，5 000 個細(xì)胞/孔，再設(shè)置5 個調(diào)零孔，調(diào)零孔加200 μL 完全培養(yǎng)基。置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞貼壁后，小心吸去上清液，實(shí)驗(yàn)組加入180 μL 完全培養(yǎng)基，20 μL 不同濃度的伊曲康唑工作液，使每孔的DMSO 終濃度均為0.25%，伊曲康唑濃度分別為2.5、5、10、20、40 μmol/L，每個濃度設(shè)5 個復(fù)孔。溶劑對照組加入180 μL 完全培養(yǎng)基，20 μL 2.5%的DMSO 稀釋液，使DMSO 終濃度為0.25%，設(shè)5 個復(fù)孔。空白對照組加入200 μL 完全培養(yǎng)基，設(shè)5 個復(fù)孔。37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞48 h，棄上清，每孔加入完全培養(yǎng)基90 μL、MTT 溶液10 μL，常規(guī)培養(yǎng)4 h 后棄上清，每孔加入Formazan 溶解液110 μL，于搖床上震蕩20 min，在酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm 處測量各孔的OD 值，OD 值大小與細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)。計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率=1-（實(shí)驗(yàn)孔OD值-調(diào)零孔OD 值）/（空白對照孔OD 值-調(diào)零孔OD值）×100%。

1.5 細(xì)胞遷移能力檢測 采用細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)。取對數(shù)生長期的PC-3 細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基配成細(xì)胞懸液后接種于6 孔板，每孔接種2 mL，每孔9×105個細(xì)胞，共6 個孔。置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞貼壁后，用1 mL 的槍頭在單層細(xì)胞上垂直于標(biāo)記線劃一直線，吸去培養(yǎng)基，再用PBS清洗3 次。實(shí)驗(yàn)組加入無血清培養(yǎng)基、伊曲康唑工作液配制的溶液2 mL，使DMSO的終濃度均為0.25%，伊曲康唑終濃度為20 μmol/L，對照組加入2 mL 用無血清培養(yǎng)基配制的濃度為0.25%的DMSO 溶液，每組設(shè)3 個復(fù)孔。于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)0、24 h 后在倒置顯微鏡下觀察并拍照，計(jì)算細(xì)胞的相對遷移距離。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Graphpad prism 6.01 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量數(shù)據(jù)用±s表示，兩組數(shù)據(jù)間比較使用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 伊曲康唑?qū)η傲邢侔┘?xì)胞PC-3 增殖的影響伊曲康唑處理PC-3 細(xì)胞48 h 后，實(shí)驗(yàn)組每一濃度的伊曲康唑均表現(xiàn)出PC-3 細(xì)胞增殖抑制，并且隨伊曲康唑用藥濃度增加，OD 值減小，即對PC-3 細(xì)胞增殖的抑制作用增強(qiáng)（表1）。溶劑對照組細(xì)胞48 h 后增殖抑制率為8.54%，實(shí)驗(yàn)組濃度為2.5、5、10、20、40 μmol/L 的伊曲康唑?qū)?xì)胞增殖的抑制率分別為12.22%、23.43%、35.30%、48.05%、60.09%，兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P均＜0.05）。

表1 用藥處理PC-3細(xì)胞48 h后細(xì)胞增殖活力比較（ ± s）

表1 用藥處理PC-3細(xì)胞48 h后細(xì)胞增殖活力比較（ ± s）

注：與溶劑對照組相比，*P＜0.05。

組別空白對照組溶劑對照組實(shí)驗(yàn)組2.5 μmol/L 5 μmol/L 10 μmol/L 20 μmol/L 40 μmol/L細(xì)胞增殖活力（OD值）0.4024±0.003 0.3736±0.005 0.3612±0.010*0.3234±0.009*0.2834±0.024*0.2404±0.031*0.1998±0.014*

2.2 伊曲康唑?qū)η傲邢侔┘?xì)胞PC-3 遷移的影響實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)伊曲康唑可降低癌細(xì)胞的遷移能力，對照組細(xì)胞能更快地遷移并覆蓋劃痕處。24 h后實(shí)驗(yàn)組與溶劑對照組細(xì)胞的相對遷移距離分別為0.694 7±0.022 7、1±0.016 5，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=15.41，P=0.000 1）。

3 討論

伊曲康唑在2007 年被美國食品和藥物管理局（FDA）確定為抗血管生成劑，2010 年被確定為Hedgehog 信號傳導(dǎo)抑制劑［6］。Antonarakis 的一項(xiàng)Ⅱ期臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)高劑量伊曲康唑（600 mg/d）能降低轉(zhuǎn)移性去勢抵抗性前列腺癌患者的循環(huán)腫瘤細(xì)胞計(jì)數(shù)但睪酮和硫酸脫氫表雄酮水平不受影響，其臨床活性獨(dú)立于雄激素調(diào)節(jié)，其機(jī)制可能與抑制Hedge?hog信號有關(guān)［7］。SUZMAN等［8］報(bào)道過1例65歲生化復(fù)發(fā)的前列腺癌患者接受伊曲康唑300 mg 治療，2次/天，12 周后PSA 水平下降50%以上，睪酮水平無明顯變化，5 個月后，患者因高膽紅素血癥停止治療，PSA 水平上升，發(fā)現(xiàn)伊曲康唑能有效降低PSA 水平。一系列臨床試驗(yàn)表明伊曲康唑?qū)η傲邢侔┲委熡羞m度的臨床療效，但其對癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及作用機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，濃度為2.5、5、10、20、40 μmol/L 的伊曲康唑溶液均表現(xiàn)出對PC-3 細(xì)胞增殖的抑制作用，并且隨用藥濃度增加，抑制作用增強(qiáng)。伊曲康唑能明顯降低癌細(xì)胞的遷移能力，20 μmol/L 的伊曲康唑溶液處理PC-3 細(xì)胞24 h后，細(xì)胞遷移抑制率為31%。

本研究還預(yù)測了伊曲康唑影響前列腺癌細(xì)胞增殖與遷移的機(jī)制，首先使用SWISS Target、STITCH、STRING 數(shù)據(jù)庫預(yù)測伊曲康唑的作用靶點(diǎn)，其中直接靶點(diǎn)40 個、間接靶點(diǎn)219 個。從TCGA 數(shù)據(jù)庫中下載了1 653個樣本的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，其中前列腺癌組織樣本1 497 個，正常組織標(biāo)本156 個，分析得到差異基因3 844 個（P ＜0.05，|log2FC| ＞1.0）。藥物和疾病的交集靶點(diǎn)69 個。利用DAVID 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行KEGG 富集分析，發(fā)現(xiàn)伊曲康唑可能通過調(diào)節(jié)cAMP、Ca2+信號通路、癌癥途徑影響前列腺癌細(xì)胞的增殖和遷移，P分別為0.032 3、0.005 2、0.023 8。

伊曲康唑可能通過調(diào)節(jié)cAMP、Ca2+信號通路抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖。鈣信號是多種細(xì)胞過程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，細(xì)胞生存取決于鈣動態(tài)平衡。大量的鈣離子內(nèi)流導(dǎo)致癌細(xì)胞快速而強(qiáng)烈的增殖，而鈣離子濃度低的癌細(xì)胞生長受到抑制［9］。在前列腺癌中，Ca2+進(jìn)入癌細(xì)胞激活T 細(xì)胞核因子（NFAT）轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)前列腺癌上皮細(xì)胞的增殖，雄激素非依賴性前列腺腫瘤細(xì)胞系也表達(dá)多種能夠升高Ca2+水平的通道［10］。諸多惡性腫瘤與高鈣血癥有關(guān)，高鈣血癥可促進(jìn)腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移，并被認(rèn)為是疾病末期的標(biāo)志。鈣通道阻滯劑已被證明可以影響細(xì)胞的增殖，細(xì)胞內(nèi)Ca2+的輕微上調(diào)可促進(jìn)多種腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展，而持續(xù)的大量的Ca2+流入可能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡，Ca2+這一復(fù)雜的雙重功能仍有待深入研究［11］。環(huán)磷酸腺苷（cAMP）是參與信號級聯(lián)反應(yīng)的第二信使，已成為包括癌癥在內(nèi)的多種疾病治療的靶點(diǎn)［12］。比如，cAMP 途徑在胰腺導(dǎo)管腺癌及其癌前病變中普遍被激活，cAMP 的大量外流觸發(fā)細(xì)胞增殖過程，引起患者的低生存率［13］。而前列腺細(xì)胞內(nèi)cAMP 介導(dǎo)的信號通路長期與上皮性腫瘤的發(fā)生和癌癥的進(jìn)展有關(guān)，在體外培養(yǎng)的前列腺癌細(xì)胞中，cAMP能抑制癌細(xì)胞增殖［14］。

伊曲康唑可能通過調(diào)節(jié)Ca2+信號通路、癌癥途徑抑制前列腺癌細(xì)胞的遷移。Ca2+通過調(diào)控鋅指轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)介導(dǎo)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換，減少腫瘤細(xì)胞與基底膜的黏附，有利于細(xì)胞遷移［15］。同時，在KEGG 富集的通路中，我們發(fā)現(xiàn)癌癥途徑富集的基因MMP-1、MMP-9 也與癌細(xì)胞遷移密切相關(guān)。基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是一組蛋白水解酶，其活性的發(fā)揮需要Ca2+、Zn2+等金屬離子的輔助［16］。miRNA是一組小非編碼RNA，能調(diào)節(jié)MMP 基因的表達(dá)，MMP-1是MMPs的一個家族成員，它作為蛋白酶激活受體1（PAR1）的激動劑，涉及大量的病理生理過程，如MMP-1 激活PAR1 并發(fā)揮親腫瘤功能，包括增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞通透性促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)蛋白活化以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞血管生成［17］。MMP-1 在黑色素瘤、宮頸癌、頭頸癌多種腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)失調(diào)促進(jìn)癌細(xì)胞遷移，提示患者生存期更短，預(yù)后不良，MMP-1 不僅對胞外基質(zhì)降解和細(xì)胞入侵有直接作用，還可以通過降解其他生物活性蛋白的受體來調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞遷移［18］。MMP-1 表達(dá)水平與前列腺癌腫瘤轉(zhuǎn)移范圍呈正比，抑制MMP-1 活性能抑制大鼠前列腺癌肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生率［19］。研究［20］發(fā)現(xiàn)，MMP-9 可降解間質(zhì)膠原，促進(jìn)癌細(xì)胞侵入基質(zhì)屏障并通過組織間質(zhì)遷移，MMP-9 在前列腺癌組織中的表達(dá)高于癌旁正常組織，同樣能促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。

綜上所述，伊曲康唑能有效抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖和遷移，這可能是通過調(diào)控cAMP、Ca2+信號通路、癌癥途徑實(shí)現(xiàn)的，但其具體機(jī)制仍有待實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。