miR-144-3p 對卵巢癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響及機制

喬素青，李涵，曹妍，邢輝，郭紅，奉澤錦

1中國人民解放軍聯勤保障部隊第九八一醫院，河北承德067000；

2湖北文理學院附屬醫院（襄陽市中心醫院）；3廣元市中心醫院

卵巢癌是女性生殖系統常見的惡性腫瘤，其病死率居婦科惡性腫瘤第一位［1］。盡管手術、放化療、分子靶向等治療方法已使卵巢癌患者的生存得到明顯改善，但中國卵巢癌的發病率和病死率仍居高不下。卵巢癌發病早期缺乏明顯的癥狀且缺乏特異性腫瘤標記物，多數患者確診時已處于中晚期［2］。卵巢癌的復發率、轉移率極高，是卵巢癌患者死亡的主要原因。目前，其復發和轉移的具體機制尚未闡明［3］。微小RNA（miRNA）是一類小分子非編碼單鏈RNA，在轉錄后水平抑制靶mRNA 的翻譯或降解mRNA，參與調控細胞的增殖、分化、凋亡等生物學行為［4］。研究顯示，miR-144-3p 可抑制胰腺癌、胃癌、甲狀腺乳頭狀癌等腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲，參與腫瘤的發生發展［5-7］。卵巢癌組織中miR-144-3p 低表達，與患者病理分期、淋巴結轉移、分化程度等臨床病理特征密切相關［8］。但目前，miR-144-3p 對卵巢癌細胞生物學行為的影響尚不明確。2018 年12 月—2019 年10 月，我們探討miR-144-3p對卵巢癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響及作用機制，以期為卵巢癌的分子靶向治療提供新靶點。

1 材料與方法

1.1 材 料 收 集35 例2016 年5 月—2018 年10 月于四川省廣元市中心醫院手術切除的卵巢癌組織及對應的癌旁組織（距離癌組織＞3 cm，且病理檢測未發現癌細胞）。卵巢癌患者年齡37～61（53.28 ±6.47）歲，經術后病理診斷確診。根據國際婦產科聯盟（FIGO）2006 年的分期標準，Ⅰ～Ⅱ期19例，Ⅲ～Ⅳ期16 例；病理類型：低級別漿液性癌（LGSC）3 例，高級別漿液性癌（HGSC）16例，黏液性癌10例，子宮內膜樣癌6 例。所有患者臨床資料完整，術前未進行放、化療等治療。本研究經四川省廣元市中心醫院倫理醫學委員會批準同意，患者自愿簽署知情同意書。卵巢癌ES-2 細胞購自中國科學院上海細胞所；胎牛血清（FBS）和RPMI 1640 培養基購自Gibco 公司；胰蛋白酶和MTT 購自美國Sigma 公司；TRIzol 試劑、逆轉錄試劑盒和PCR 試劑盒購自美國Fermentas公司；CyclinD1、MMP2 和MMP9 多克隆抗體購自美國Abcam 公司；p-PI3K、p-Akt 和p-mTOR 多克隆抗體購自美國CST公司；LipofectamineTM2000試劑盒購自美國Invitrogen 公司；miR-144-3p 模擬物（mimics）及陰性對照、GREM1 過表達載體、突變型（MUT）和野生型（WT）GREM1 的3'-非翻譯區（3'UTR）熒光素酶報告載體購自上海吉凱基因公司包裝合成；雙熒光素酶活性檢測試劑盒購自美國Promega 公司；BCA蛋白測定試劑盒購自北京索萊寶公司。

1.2 卵巢癌和癌旁組織中miR-144-3p、GREM1 mRNA表達檢測 采用qRT-PCR法。在液氮保護下，研磨卵巢癌組織和癌旁組織，采用TRIzol試劑提取組織中總RNA。經核酸儀檢測RNA 純度和濃度之后，參照逆轉錄試劑盒操作說明，將其逆轉錄為cDNA。然后以cDNA為模板進行擴增。擴增條件：95 ℃預變性1 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共45 個 循 環。采 用2-ΔΔCt法 計 算miR-144-3p 和GREM1 mRNA的相對表達量。

1.3 ES-2 細胞培養和分組轉染 從液氮罐中取出ES-2細胞，快速溶解后，轉移至15 mL離心管中。預冷的PBS 清洗后，加入含10%FBS 的RPMI1640 培養基，轉至25 cm2培養瓶中，置于37 ℃、5%CO2、97%濕度的培養箱中培養。每2～3 天更換1 次新鮮的培養基，待細胞融合至80%時，0.25%胰蛋白溶液消化，進行傳代培養。取對數生長期的ES-2細胞，以2.5×105個/mL 的濃度接種于24 孔板中。細胞融合至60%時，參照LipofectamineTM2000 試劑盒說明書分組轉染。miR-144-3p 組轉染miR-144-3p 模擬物（mimics）；miR-con 組轉染模擬陰性對照物；antimiR-144-3p 組轉染miR-144-3p 抑制劑；anti-miR-con組轉染抑制劑陰性對照；si-GREM1 組轉染GREM1的小干擾RNA；si-con 組轉染非特異性小干擾RNA；miR-144-3p+pcDNA-GREM1 組共轉染miR-144-3p mimics 和GREM1 過表達載體；miR-144-3p+pcDNAcon 組共轉染miR-144-3p mimics 和空載體。轉染后12 h，更換新鮮培養基，繼續培養至48 h，收集細胞，用于后續實驗。同時設置對照組（NC組）：細胞正常培養。

1.4 ES-2 細胞增殖活性檢測 采用MTT 法。取各組轉染后的細胞，以2.5×104/mL的濃度接種于96孔板中，每孔200 μL，每組設置3個復孔。分別于培養箱中培養24、48、72 h 后，加入20 μL 濃度為5 g/L 的MTT溶液。培養箱中繼續孵育4 h，棄上清液。每孔加入150 μL的二甲基亞砜，充分振蕩溶解結晶紫，混勻后于酶標儀490 nm處測定OD值。實驗重復3次。

1.5 ES-2 細胞遷移和侵襲能力檢測 采用Tran?swell 實驗。用無血清的RPMI1640 培養基重懸各組轉染后的細胞，調整細胞濃度為2.5×105個/mL。細胞遷移實驗：取100 μL 細胞懸液加至Transwell 上室，500 μL 含10%FBS 的RPMI 1640 培養基加至下室。培養24 h后，吸棄培養液，取出小室。4%多聚甲醛固定25 min、結晶紫染色10 min后，PBS清洗，顯微鏡觀察。隨機選取5個視野計數。細胞侵襲實驗：在Transwell 上室加入細胞懸液之前，先在上室鋪設Matrigel 基質膠（Matrigel 與RPMI1640 培養基以1∶8比例稀釋），自然晾干。剩余操作同細胞遷移實驗。

1.6 細胞周期蛋白D1（CyclinD1）、基質金屬蛋白酶2（MMP-2）和MMP-9蛋白表達檢測 采用Western blot?ting法。加入蛋白裂解液，置于冰上充分裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，離心半徑3 cm。上清液為提取蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白含量。取適量蛋白變性后，每孔30 μg蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳后，將分離的蛋白經濕轉至PVDF膜，置于5%脫脂牛奶中封閉1 h。分別加入CyclinD1、MMP-2和MMP-9一抗，4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3次，每次5 min，然后加入辣根過氧化酶標記的二抗，室溫孵育1 h。TBST洗膜3次，每次5 min，加入ELC顯影液顯影。凝膠成像系統曝光拍照，Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.7 miR-144-3p和GREM1靶向關系驗證 采用雙熒光素酶報告基因實驗驗證。TargetScan在線軟件預測顯示，GREM1的3′UTR存在miR-144-3p的結合位點。PCR擴增含有miR-144-3p結合位點的GREM1 3’UTR，構建GREM1 野生型（GREM1-WT）質粒和突變型（GREM1-MUT）質粒。調整卵巢癌ES-2細胞調整濃度為2.5×105個/mL，每孔2 mL接種于6孔板中。待細胞融合至60%時，分別共轉染GREM1-WT 與miR-144-3p mimics 或miR-con、GREM1-MUT 與miR-144-3p mimics或miR-con。轉染12 h后，更換培養基。再培養24 h，收集細胞。參照雙熒光素酶活性檢測試劑盒操作說明書，檢測每組的熒光素酶活性。

1.8 統計學方法 采用SPSS22.0 統計軟件。計量數據以±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-144-3p和GREM1在卵巢癌及其對應癌旁組織中表達比較 卵巢癌及其對應癌旁組織中miR-144-3p 相對表達量分別為1.45 ± 0.13、0.51 ±0.05，GREM1 mRNA相對表達量分別為0.24 ±0.02、0.68 ± 0.06。與癌旁組織相比，卵巢癌組織中miR-144-3p表達降低（t=39.926，P＜0.05），GREM1 mRNA表達升高（t=41.158，P＜0.05）。

2.2 各組ES-2細胞中miR-144-3p和GREM1蛋白表達比較 各組細胞中miR-144-3p和GREM1蛋白表達見表1。與NC組相比，miR-144-3p組miR-144-3p表達升高，GREM1 蛋白表達降低（P＜0.05），si-GREM1 組GREM1蛋白表達降低（P＜0.05），而si-con組GREM1蛋白表達差異無統計學意義（P＞0.05）。與miR-144-3p組或miR-144-3p+pcDNA-con組相比，miR-144-3p+pcD?NA-GREM1組GREM1蛋白表達升高（P均＜0.05）。

表1 各組ES-2細胞中miR-144-3p和GREM1蛋白表達比較（ ± s）

表1 各組ES-2細胞中miR-144-3p和GREM1蛋白表達比較（ ± s）

注：與NC 組相比，*P＜0.05；與miR-144-3p+pcDNA-con 組相比，#P＜0.05。

GREM1蛋白1.00±0.09 1.00±0.10 0.40±0.05*1.00±0.11 0.35±0.05*0.45±0.05 0.80±0.10#121.855＜0.05組別NC組miR-con組miR-144-3p組si-con組si-GREM1組miR-144-3p+pcDNA-con組miR-144-3p+pcDNA-GREM1組miR-144-3p 1.00±0.10 1.02±0.10 2.01±0.20*----F P 150.045＜0.05

2.3 各組ES-2細胞增殖活性比較 NC組、miR-con組、miR-144-3p 組、si-con 組、si-GREM1 組、miR-144-3p+pcDNA-con 組 和miR-144-3p+pcDNA-GREM1 組ES-2 細 胞 存 活 率 分 別 為（100.12 ± 10.01）%、（101.10 ± 10.11）%、（50.15 ± 5.01）%、（103.11 ±10.30）%、（61.05 ± 6.10）%、（50.78 ± 0.51）%、（90.04 ± 9.01）%。與NC 組相比，miR-144-3p 組和si-GREM1 組ES-2 細胞存活率降低（P 均＜0.05），而miR-con 組和si-con 組細胞存活率差異無統計學意義（P 均＞0.05）。與miR-144-3p 組或miR-144-3p+pcDNA-con 組 相 比，miR-144-3p+pcDNA-GREM1 組ES-2細胞存活率升高（P＜0.05）。

2.4 各組ES-2細胞遷移和侵襲能力比較 各組細胞遷移數和侵襲數見表2。與NC組相比，miR-144-3p組和si-GREM1 組ES-2 細胞遷移和侵襲數降低（P 均＜0.05），而miR-con組和si-con組ES-2細胞遷移和侵襲數差異無統計學意義（P均＞0.05）。與miR-144-3p組或miR-144-3p+pcDNA-con組相比，miR-144-3p+pcDNAGREM1組ES-2細胞遷移和侵襲數升高（P均＜0.05）。

2.5 各組ES-2 細胞中CyclinD1、MMP2 和MMP9 蛋白表達水平比較 與NC 組相比，miR-144-3p 組和si-GREM1 組ES-2 細胞中CyclinD1、MMP2 和MMP9蛋白表達降低（P 均＜0.05），而miR-con 組和si-con組細胞中CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表達差異無統計學意義（P 均＞0.05）。與miR-144-3p 組或miR-144-3p+pcDNA-con 組 相 比，miR-144-3p+pcDNAGREM1 組ES-2 細胞中CyclinD1、MMP2 和MMP9 蛋白表達升高（P均＜0.05）。見表3。

表2 各組ES-2細胞遷移和侵襲數比較（個， ± s）

表2 各組ES-2細胞遷移和侵襲數比較（個， ± s）

注：與NC 組相比，*P＜0.05；與miR-144-3p+pcDNA-con 組相比，#P＜0.05。

細胞侵襲數152.04±15.21 148.46±15.01 69.03± 7.00*153.25±15.32 56.33± 5.65*66.78± 6.72 135.08±13.06#129.188＜0.05組別NC組miR-con組miR-144-3p組si-con組si-GREM1組miR-144-3p+pcDNA-con組miR-144-3p+pcDNA-GREM1組F P細胞遷移數231.01±23.10 238.21±23.81 110.04±11.01*230.88±23.01 140.26±14.05*112.89±11.30 213.40±21.34#85.571＜0.05

2.6 miR-144-3p 靶 向 調 控GREM1 表 達 Tar?getScan 在線軟件預測顯示，GREM1 的3′UTR 存在miR-144-3p 的結合位點。miR-144-3p+GREM1-WT共轉染組、miR-con+GREM1-WT 共轉染組的熒光素酶活性分別為0.40 ± 0.05、1.00 ± 0.10，兩組比較差異有統計學意義（t=16.100，P＜0.05）；miR-144-3p+GREM1-MUT 共 轉染 組、miR-con+GREM1-MUT組的熒光素酶活性分別為1.05 ± 0.10、1.00 ±0.10，兩組比較比較差異無統計學意義（t=1.061，P=0.305），miR-144-3p組、miR-con組GREM1蛋白相對表達量分別為0.45 ± 0.05、1.00 ± 0.10，兩組比較差異有統計學意義（t=14.758，P＜0.05），anti-miR-144-3p 組、anti-miR-con 組GREM1 蛋白相對表達量分別為1.45 ± 0.15、1.10 ± 0.11，兩組比較差異有統計學意義（t=5.645，P＜0.05）。

3 討論

miRNA在真核生物體內廣泛存在，其通過參與細胞生長、分化、炎癥反應等過程對約60%的人類基因進行監管［9］。近年來，隨著對miRNA 研究的深入，發現miRNA參與腫瘤的發生發展，其類似于癌基因或抑癌基因的作用［10］。研究表明miR-144-3p在宮頸癌組織中表達下調，過表達miR-144-3p通過靶向MAPK6抑制宮頸癌細胞的生長和轉移，可作為宮頸癌的新型治療靶標［11］。本研究結果顯示，miR-144-3p在卵巢癌組織中表達降低，與相關研究報道結果一致［12］，提示miR-144-3p 參與卵巢癌的發生發展。miR-144-3p mimics轉染卵巢癌ES-2細胞，抑制了ES-2細胞的增殖、遷移和侵襲能力，說明miR-144-3p是卵巢癌治療的潛在分子靶點，其作用機制有待進一步探討。

GREM1是一種分泌性蛋白，屬于骨形態拮抗劑家族成員，對胚胎發育、生長和細胞分化具有調節作用［13］。研究顯示，GREM1過表達可促進膠質瘤細胞的增殖和遷移［14］，沉默GREM1表達可抑制結腸癌細胞的增殖和遷移［15］。本研究結果顯示，GREM1在卵巢癌組織中高表達，抑制GREM1表達可降低卵巢癌ES-2 細胞的增殖、遷移和侵襲能力，表明GREM1 在卵巢癌中作為促癌基因發揮作用。MIAO 等［16］研究表明，上調miR-137 表達通過負調節GREM1 來阻斷TGF-β/smad通路，從而抑制CC細胞的增殖、集落形成、遷移和侵襲。為了進一步探討miR-144-3p 抑制卵巢癌ES-2 細胞的增殖、遷移和侵襲能力的調控機制，本研究使用TargetScan 在線軟件預測顯示，GREM1 可能是miR-144-3p 的靶基因。雙熒光素酶報告基因證實miR-144-3p 可與GREM1 的3′UTR 靶向結合。上調ES-2 細胞中miR-144-3p 表達后，GREM1蛋白表達降低，而下調ES-2細胞中miR-144-3p 表達后GREM1 蛋白表達升高，說明miR-144-3p靶向負調控GREM1表達。GREM1過表達逆轉了高表達miR-144-3p 對ES-2 細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用，提示miR-144-3p 通過靶向下調GREM1 表達抑制ES-2細胞的增殖、遷移和侵襲。

綜上所述，miR-144-3p 在卵巢癌組織中呈低表達，高表達miR-144-3p 可抑制卵巢癌細胞的增殖、遷移和侵襲，其可能通過下調GREM1表達進而抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路的激活發揮作用。

表3 各組ES-2細胞中CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表達比較（ ± s）

表3 各組ES-2細胞中CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表達比較（ ± s）

注：與NC組相比，*P＜0.05；與miR-144-3p+pcDNA-con組相比，#P＜0.05。

組別NC組miR-con組miR-144-3p組si-con組si-GREM1組miR-144-3p+pcDNA-con組miR-144-3p+pcDNA-GREM1組F P MMP9 0.72±0.07 0.75±0.07 0.30±0.05*0.75±0.07 0.36±0.05*0.30±0.05 0.60±0.09#94.188＜0.05 CyclinD1 1.00±0.10 1.05±0.10 0.35±0.05*1.05±0.10 0.35±0.05*0.40±0.05 0.88±0.08#166.893＜0.05 MMP2 0.80±0.08 0.85±0.08 0.15±0.02*0.82±0.08 0.40±0.05*0.18±0.03 0.65±0.06#206.575＜0.01