沉默HMGB1 基因對HSP 患兒血清IgA1 誘導血管內皮細胞凋亡、通透性的影響及機制

馬立顯，侯海燕，侯艷梅

1 延安大學咸陽醫院，陜西咸陽712000；2 寶雞市婦幼保健院兒童醫院；3 延安大學基礎醫學院

過敏性紫癜（HSP）是臨床上常見的兒童小血管炎性綜合征［1］，其主要病理機制是以免疫球蛋白A（IgA）尤其是IgA1 為主的循環免疫復合物沉積于局部的小血管中，形成不伴有血小板減少及凝血功能障礙的皮膚紫癜、關節炎、腹痛或腎功能受損性疾病［2］。既往研究證實，HSP 患者血清中IgA1 表達顯著高于健康人群，且分離的IgA1 能夠誘導血管內皮細胞發生凋亡［1］。而結合近年來的研究表明，這可能與HSP患者血清中IgA1的半乳糖缺陷有關［3］。內皮細胞作為血液與血管平滑肌之間的重要屏障，能夠選擇性地抑制血液中某些成分（如血漿脂蛋白、免疫復合物等）進入血管壁，維護血管正常的功能狀態［4］。但當內皮細胞受到不良誘導發生凋亡時，將會誘發血管內皮的通透性增加，使其屏障功能受損，進而造成血管壁通透性也隨之增加，導致血液中的成分穿過血管壁并沉積其上，最終誘發血管炎。高遷移率蛋白1（HMGB1）是一種促炎因子，其在多種炎癥及自身免疫性疾病中均發揮重要作用［5］。研究發現，HMGB1 參與調節多種血管炎性疾病［6］，其在HSP 患兒血清中的水平顯著升高，但在HSP 中的具體作用機制鮮有報道［7］。鑒于此，本研究靶向沉默人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）中HMGB1 的表達，并以HSP 患兒血清IgA1 誘導細胞，以探究HMGB1 在HSP中的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 血清IgA1 由本實驗室分離，HU?VEC（北京維通利華實驗動物技術有限公司），RP?MI1640、DMEM/HG、0.25%胰蛋白酶（美國Hyclone公司）；TRIzol 試劑（美國Invitrogen 公司）；胎牛血清（FBS）、青鏈霉素混合液（浙江天杭生物科技股份有限公司）均為100 U/mL；內皮細胞生長因子（ECGS，美國Sciencecell 公司），PCR 試劑盒（日本TaKaRa 公司），DAPI 試劑、羅丹明—鬼比環肽（美國Sigma 公司）；LipofectamineTM3000（美國Invitrogen 公司）；FITC 標記的山羊抗兔IgG（美國Biolegend 公司）；靶向沉默HMGB1基因的小干擾RNA（si-HMGB1）及其陰性對照序列（si-NC）（上海吉瑪制藥技術有限公司）；Jacalin 親和層析柱（美國Pierce Rockford 公司）；TUNEL凋亡檢測試劑盒（瑞士Roche公司），An?nexin V-FITC 試劑盒（江蘇碧云天生物技術有限公司），ELISA 試劑盒（美國BD 公司）；兔抗核因子κB（NF-κB）p65、B 淋巴細胞瘤-2 基因（Bcl-2）、Bcl-2 相關X 蛋白（Bax）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3（Caspase-3）、β-actin 單克隆抗體（美國Abcam 公司）；辣根過氧化酶標記（HRP）的山羊抗兔IgG（武漢博士德生物工程有限公司）；其他試劑均為國產分析純。電泳槽、電泳儀及化學發光熒光成像系統（美國Bio-Bad公司）。

1.2 血清IgA1 分離 參考文獻［8］利用固定化Jaca?lin 親和層析柱分離受試者［18 例HSP 患兒，男11例、女7例，年齡（8.3±2.6）歲；20例體檢健康兒童，男10例、女10例，年齡（7.7±3.1）歲］血清IgA1。

1.3 HUVEC 培養及分組 常規復蘇HUVEC 后使用 含10% FBS、1% 青 鏈 霉 素、10 ng/mL ECGS 的DMEM/HG 培養液于37 ℃、5% CO2恒溫培養箱進行培養。待HUVEC 貼壁生長融合至80% 時，用0.25%的胰蛋白酶進行消化傳代；轉染前24 h，取處于對數生長期的HUVEC 常規消化，按1×106/mL 接種于6 孔板中，待細胞生長融合至80%時，根據Li?pofectamineTM3000 說明書方法將si-HMGB1、si-NC 轉染入HUVEC 中。將轉染后的細胞置于37℃、5%CO2恒溫培養箱中培養8 h，用實時熒光定量PCR（RT-PCR）法檢測轉染效率，證明轉染成功。取上述轉染后的HUVEC 隨機分組，si-NC+serum 組、si-HMGB1+serum 組分別加入250 μg/mL 健康兒童血清IgA1，si-NC+HSP 組、si-HMGB1+HSP 組分別加入250 μg/mL HSP患兒血清IgA1，均置于37 ℃、5%CO2恒溫培養箱培養12 h，取各組細胞上清液，收集細胞以備后續實驗使用。

1.4 HUVEC 上清液中TNF-α、IL-8 檢測 采用ELISA 法檢測細胞上清液中TNF-α、IL-8。實驗重復3次，取平均值。

1.5 HUVEC凋亡檢測 采用流式細胞術。取各組細胞，在半徑13.5 cm 的離心機中1 5 00 r/min 離心5 min，棄上清，用4 ℃預冷的PBS 洗滌細胞2 次，半徑13.5 cm 的離心機中2 000 r/min 離心5 min，收集細胞沉淀，用195 μL Annexin V-FITC 結合液重懸細胞，并調整細胞至7×105個/mL；依次加入5 μL An?nexin V-FITC及10 μL PI染色液，輕輕搖晃離心管充分混勻，室溫下避光孵育0.5 h。300 目濾膜過濾細胞團塊后用流式細胞儀進行檢測。實驗重復3 次，取平均值。

1.6 單層HUVEC 細胞膜通透性檢測 取1.3.2 轉染 后 的HUVEC，按1×105個/孔 接 種 于24 孔 板 的Transwell 小室中，分別于上室及下室中加入100、600 μL 的DMEM/HG 培養液，于37 ℃、5% CO2恒溫培養箱培養24 h，待細胞生長融合至單層內皮細胞后，更換上、下室的培養液為不含FBS 與酚紅的DMEM/HG 培養液，培養4 h 后進行透光性檢測。對轉染后的細胞進行分組處理（同1.3.2 中），同時上室加入100 μL FITC 標記的葡聚糖FD40（1 μg/mL），培養5 min 后取下室培養液200 μL 于熒光分光光度計中檢測葡聚糖FD40的熒光強度作為基礎值，下室中補充等體積的DMEM/HG。于培養箱中分別培養3、6、12、24 h，再次取200 μL的下室培養液按上述方法檢測葡聚糖FD40 的熒光強度。每組每個時間點設置5 個復孔。應用各組最終檢測值減去基礎值作為葡聚糖FD40 的熒光強度值，計算單層HUVEC 對葡聚糖FD40的通透性系數，并將其作為評價細胞膜通透性的指標。

1.7 HUVEC 中p65-NF-κB、Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達檢測 采用Western blotting法。取各組細胞，RIPA細胞裂解液及蛋白酶抑制劑提取內皮細胞中的總蛋白。BCA法進行蛋白定量，按1∶4向上清液中加入5×上樣緩沖液，并于沸水中加熱變性10 min。取30 μg蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，采用濕轉法將分離的蛋白轉至PVDF 膜上，5%的脫脂牛奶于室溫下封閉2 h，分別加p65-NF-κB（1∶300）、Bax（1∶500）、Bcl-2（1∶500）、Caspase-3（1∶500）、β-actin（1∶1 000）一抗，4 ℃搖床孵育過夜。TBST溶液清洗3次，5 min/次，以辣根過氧化酶標記的二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，以TBST 溶液清洗3 次，5 min/次。滴加ECL 發光液后于凝膠成像儀進行曝光拍照。Image J 軟件測定條帶灰度值，以目標蛋白與內參βactin 的比值作為其相對表達量。以上實驗重復3次，取平均值。

1.8 統計學方法 采用SPSS19.0 統計軟件。計量資料用±s表示，比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 沉默HMGB1 基因對HSP 血清中IgA1 誘導的HUVEC 因子的影響 與si-NC+serum 組比較，si-NC+HSP 組、si-HMGB1+HSP 組上清液中TNF-α、IL-8 水平高（P 均＜0.05）；si-NC+serum 組與si-HMGB1+serum 組上清液中TNF-α、IL-8 水平比較差異無統計學意義（P 均＞0.05）。與si-NC+HSP 組比較，si-HMGB1+HSP 組上清液中TNF-α、IL-8 水平低（P 均＜0.05）。見表1。

表1 各組上清液中TNF-α、IL-8水平比較（ng/L， ± s）

表1 各組上清液中TNF-α、IL-8水平比較（ng/L， ± s）

注：與si-NC+serum 組相比，*P＜0.05；與si-NC+HSP 組相比，#P＜0.05。

IL-8 98.20±4.72 92.14±5.15 186.33±9.72*127.20±4.51*#組別si-NC+serum組si-HMGB1+serum組si-NC+HSP組si-HMGB1+HSP組TNF-α 63.14± 9.05 59.81± 5.66 135.52±10.04*89.14± 2.67*#

2.2 沉默HMGB1 基因對HSP 患兒血清IgA1 誘導HUVEC 凋亡的影響 si-NC+serum 組、si-HMGB1+serum組、si-NC+HSP組、si-HMGB1+HSP組凋亡率分別 為（3.41 ± 0.85）%、（4.00 ± 0.71）%、（16.79 ±1.05）%、（9.26±1.12）%。與si-NC+serum 組相比，si-NC+HSP 組、si-HMGB1+HSP 組凋亡率高（P 均＜0.05）；si-NC+serum 組與si-HMGB1+serum 組凋亡率比較差異無統計學意義（P＞0.05）。與si-NC+HSP組比較，si-HMGB1+HSP組凋亡率低（P＜0.05）。

2.3 沉默HMGB1 基因對HSP 患兒血清IgA1 誘導HUVEC 細胞膜通透性的影響 與si-NC+serum 組相比，si-NC+HSP 組、si-HMGB1+HSP 組隨著IgA1 誘導時間延長，細胞通透性逐漸升高，且呈時間依賴性，誘導12、24 h 時通透性高（P 均＜0.05）；si-NC+serum組與si-HMGB1+serum 組各時間點細胞膜通透性比較差異無統計學意義（P 均＞0.05）。與si-NC+HSP組相比，si-HMGB1+HSP 組細胞膜通透性在誘導12、24 h時低（P均＜0.05）。見表2。

2.4 沉默HMGB1 基因對HSP 患兒血清IgA1 誘導HUVEC中NF-κB信號通路的影響 與si-NC+serum組細胞相比，si-NC+HSP組、si-HMGB1+HSP組p65-NFκB、Bax、Caspase-3蛋白相對表達量高，Bcl-2蛋白相對表達量低（P均＜0.05）；si-NC+serum 組與si-HMGB1+serum組上述蛋白相對表達量比較差異無統計學意義（P均＞0.05）。與si-NC+HSP組相比，si-HMGB1+HSP組細胞中p65-NF-κB、Bax、Caspase-3蛋白相對表達量低，Bcl-2蛋白相對表達量高（P均＜0.05）。見表3。

表2 各組細胞膜通透性比較（ ± s）

表2 各組細胞膜通透性比較（ ± s）

注：與si-NC+serum組相比，*P＜0.05；與si-NC+HSP組相比，#P＜0.05。

組別si-NC+serum組si-HMGB1+serum組si-NC+HSP組si-HMGB1+HSP組通透性系數誘導24 h 1.61±0.31 1.59±0.77 3.11±0.94*2.54±0.56*#誘導3 h 0.93±0.40 0.89±0.37 1.03±0.52 0.97±0.58誘導6 h 1.29±0.57 1.30±0.11 1.39±0.56 1.36±0.38誘導12 h 1.40±0.33 1.44±0.25 2.51±0.83*1.82±0.61*#

表3 各組NF-κB信號通路相關蛋白表達比較（ ± s）

表3 各組NF-κB信號通路相關蛋白表達比較（ ± s）

注：與si-NC+serum組相比，*P＜0.05；與si-NC+HSP組相比，#P＜0.05。

組別si-NC+serum組si-HMGB1+serum組si-NC+HSP組si-HMGB1+HSP組Bcl-2蛋白1.13±0.41 1.09±0.38 0.37±0.17*0.65±0.20*#p65-NF-κB蛋白0.08±0.03 0.11±0.04 0.76±0.11*0.42±0.06*#Bax蛋白0.06±0.02 0.05±0.03 0.84±0.11*0.39±0.15*#Caspase-3蛋白0.05±0.01 0.06±0.03 0.74±0.18*0.33±0.11*#

3 討論

內皮細胞在血管損傷的局部免疫和炎癥調節中起關鍵作用，而血管內皮細胞由于其在血管壁中的特殊定位，更易受免疫介導的相關損傷［9］。內皮細胞的損傷或凋亡使其喪失屏障功能的完整性，增加內皮的通透性，進而導致全身免疫性疾病如血管炎、炎癥性腸病及多發性硬化等的發生［10］。HSP主要由IgA1 循環免疫復合物介導的兒童免疫性血管炎中最常見的小血管炎癥性疾病［1］。近年來，越來越多的研究證實，血管內皮細胞凋亡在HSP 的發病機制中起重要作用。大量數據報道HSP 患兒血清IgA1能夠誘導血管內皮細胞的凋亡［4-5］，而后者會損傷內皮屏障功能，進一步加劇HSP的進展［11］。

HMGB1 是一種廣泛存在于各種細胞類型中的核蛋白，其不僅能夠在細胞內發揮相應作用，還能夠被釋放至細胞外，激活并介導先天性免疫［8］。此外，有研究發現，HMGB1涉及血管炎性疾病中的多種細胞凋亡過程，如在失血性休克誘導的SIRS 小鼠模型中來源于血小板的HMGB1 能夠招募單核細胞的聚集，并抑制其發生凋亡從而促進疾病的進展［12］。而在類風濕關節炎中，關節滑膜組織中高表達的HMGB1 能夠通TLR4/Akt/mTOR 信號通路影響自噬水平，進而抑制滑膜成纖維細胞的凋亡，誘導疾病的急性發作［13］。此外，在內皮細胞通透性方面，國內學者胡博等［14］研究發現，普通肝素能夠通過NF-κB 通路保護HMGB1 介導的內皮細胞損傷，從而改善其通透性改變，保護內皮的屏障作用。鄭運江等［15］同樣發現，HMGB1 能誘導內皮細胞的通透性改變，其可能通過激活小分子鳥苷酸Rho，進而損傷內皮屏障功能的完整性。本研究通過siRNA沉默內皮細胞中HMGB1 表達，分離HSP 患兒血清中的IgA1，探究沉默HMGB1 基因對HSP 血清中IgA1 誘導內皮細胞凋亡及通透性改變的影響。結果顯示HSP 血清中的IgA1 能夠顯著誘導HUVEC 中HMGB1 的表達，而沉默細胞中HMGB1基因可能通過NF-κB途徑，抑制凋亡相關蛋白Bax、Caspase-3 表達，上調抗凋亡蛋白Bcl-2表達，從而下調內皮細胞對HSP標志性炎性因子TNF-α、IL-8的分泌，抑制HSP患兒血清中IgA1誘導的內皮細胞凋亡，降低內皮細胞的通透性。

NF-κB在炎性反應及細胞凋亡中起著重要的作用。NF-κB 在細胞中以無活性形式存在，當其被上游信號（如炎性因子）激活后發生磷酸化，并釋放p65，進而進行磷酸化及核轉位。而p65 是NF-κB 家族成員中最為關鍵的轉錄因子，其表達水平可作為NF-κB 途徑的活性指標［16］。Bax 是分布于細胞質中的重要促凋亡蛋白，其在接受上游傳導的凋亡信號后被激活并發生分子構象的改變，隨即進入線粒體并破壞線粒體膜的完整性，其還可以與凋亡抑制蛋白Bcl-2 相結合，對抗其抗凋亡作用。凋亡蛋白酶Caspase-3 是各種凋亡途徑的樞紐分子，也是細胞凋亡的指示劑，它的激活表示細胞已進入凋亡早期，并最終發生細胞死亡［16］。

綜上所述，沉默HMGB1基因可能通過NF-κB通路抑制HSP 患兒血清IgA1 誘導的細胞凋亡，降低內皮細胞的通透性，從而保護內皮屏障功能。本研究為HMGB1 在HSP 發病過程中的作用機制提供新的見解，有望為HSP治療提供新的靶點。