胃癌患者血清miR-663、sHLA-G 的表達(dá)及意義

唐雪峰，張蝶，張磊

1 天津市第三中心醫(yī)院，天津300170；2天津市重癥疾病體外生命支持重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3 天津市人工細(xì)胞工程技術(shù)研究中心；4天津市肝膽研究所

胃癌是消化系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，是源于上皮細(xì)胞的一種腫瘤，惡性度高，易轉(zhuǎn)移。世界范圍內(nèi)東亞地區(qū)發(fā)病率最高［1］。經(jīng)常食用腌制品、幽門螺桿菌感染是罹患胃癌的高危因素［2］。對(duì)于早期胃癌患者，手術(shù)是最佳的治療策略，但部分患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于晚期或伴有轉(zhuǎn)移，需化療和靶向治療［3］。微小RNA（miRNA）是一類長(zhǎng)度約為22 個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA，具有調(diào)控基因表達(dá)的重要作用［4］。miRNA 在多種癌癥中均有異常表達(dá)，如結(jié)直腸癌、肝癌［5］，表明miRNA 與癌細(xì)胞的增殖、分化、轉(zhuǎn)移及預(yù)后有關(guān)。近年來(lái)，關(guān)于miR-663 的研究報(bào)道逐漸增多。研究顯示，miR-663 在甲狀腺乳頭癌中呈異常表達(dá)，在癌癥發(fā)展中發(fā)揮抑制作用［6］；亦有研究顯示，miR-663具有促進(jìn)癌細(xì)胞增殖分化的作用［7］。目前，miR-663 在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制尚不清楚。人白細(xì)胞抗原-G（HLA-G）是一種主要組織相容性復(fù)合體（MHC），當(dāng)體內(nèi)有炎癥時(shí)，HLA-G 便以可溶性人類白細(xì)胞抗原-G（sHLA-G）形式出現(xiàn)于外周血中，進(jìn)而對(duì)機(jī)體內(nèi)環(huán)境進(jìn)行調(diào)節(jié)［8］。研究表明，sHLA-G在甲狀腺癌發(fā)展中發(fā)揮重要作用，并與疾病的侵襲性有關(guān)［6］，但兩指標(biāo)在胃癌中的具體作用機(jī)制報(bào)道較少。2017 年3 月—2019 年8 月，我們檢測(cè)了胃癌患者血清中miR-663、sHLA-G 的表達(dá)并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017 年3 月—2019 年8 月于天津市第三中心醫(yī)院住院治療的胃癌患者82例（胃癌組），其中男56 例、女26 例，年齡45～64（50.39 ±2.41）歲，其中≥50歲37例，＜50歲45例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者經(jīng)病理檢查明確診斷為胃癌；②患者均為首次診斷胃癌，未接受過(guò)任何方式的抗腫瘤治療；③本研究經(jīng)天津市第三中心醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，血液標(biāo)本的采集和臨床資料收集均獲得受檢者本人知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有其他系統(tǒng)惡性腫瘤者，如肺癌、肝癌等；②有免疫功能缺陷者；③并發(fā)全身感染性疾病者。TNM 分期及病理分化程度參考第8版美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)標(biāo)準(zhǔn)［9］。組織分化程度為中低分化51例，高分化31 例；TNM 分期：Ⅰ期44 例，Ⅱ期24 例，Ⅲ期8例，Ⅳ期6例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移32例；腫瘤直徑＜2.5 cm 48 例，≥2.5 cm 34 例。另選同期在院體檢健康的志愿者50 例作為對(duì)照組，男30 例、女20 例，年齡47～65（45.24±2.06）歲。本研究通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者或其家屬簽署知情同意書。

1.2 血清中miR-663、sHLA-G 表達(dá)檢測(cè) 所有受試者晨起空腹抽取靜脈血約4 mL，加入到EDTA 抗凝管中，3 000 r/min 離心10 min，離心半徑12 cm 分離血清。應(yīng)用TRIzol 法提取總RNA（RNA 提取試劑盒購(gòu)自Invitrogen 公司），使用紫外分光光度儀檢測(cè)RNA 濃度，符合標(biāo)準(zhǔn)的RNA 凍存?zhèn)溆谩Ｊ褂肦NA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（購(gòu)自日本TaKaRa 公司）將提取出的RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA 為模板，使用PCR擴(kuò)增試劑盒（購(gòu)自上海生工生物工程有限公司）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。所有引物由上海生工生物工程有限公司合成，miR-663 正向引物：5'-CAGGATGAGA?CATGAGGCCA-3'，反向引物：5'-CTCTCGTGCTGC?CATACCTGAT-3'。內(nèi)參基因U6 作為對(duì)照，U6 正向引物：5'-GGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3'，反向引物：5'-CAAAGTTGTCA-TGGATGATCC-3'。反應(yīng)體系：10 μL 2×SYBR Green，1 μL 20×TaqDNA 聚合酶，1 μL 正反向引物和8 μL H2O。qPCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，55 ℃變性1 min，72 ℃延伸10 s，共40 個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本至少重復(fù)3 次試驗(yàn)，最后采集熒光信號(hào)，結(jié)果以2-ΔΔCt計(jì)算和標(biāo)準(zhǔn)化miR-663 的相對(duì)表達(dá)量。采用ELISA法檢測(cè)各組血清中sHLA-G的濃度（試劑盒購(gòu)于上海生工生物工程有限公司），操作步驟按照試劑盒的說(shuō)明書逐步進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)或校正t 檢驗(yàn)。應(yīng)用Pearson 相關(guān)檢驗(yàn)分析miR-663、sHLA-G 與胃癌發(fā)生的關(guān)系。應(yīng)用受試者工作特征（ROC）曲線評(píng)價(jià)miR-663 與sHLA-G 對(duì)胃癌的診斷價(jià)值。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組與對(duì)照組miR-663、sHLA-G 表達(dá)比較 胃癌組與對(duì)照組血清miR-663 相對(duì)表達(dá)量分別為2.604±0.712、7.113±1.205，sHLA-G 水平分別為（41.851±1.426）、（8.458±1.148）ng/mL，胃癌組血清中miR-663 表達(dá)低于對(duì)照組（P＜0.05），sHLA-G表達(dá)高于對(duì)照組（P＜0.05）。

2.2 miR-663、sHLA-G 表達(dá)與胃癌發(fā)生的關(guān)系Pearson 相關(guān)分析結(jié)果顯示，miR-663 與胃癌發(fā)生呈負(fù)相關(guān)（r=-0.922，P＜0.01），sHLA-G 與胃癌發(fā)生呈正相關(guān)（r=0.997，P＜0.01）。

2.3 胃癌組血清中miR-663、sHLA-G 表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系 胃癌組血清miR-663、sHLA-G表達(dá)與腫瘤TNM 分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P 均＜0.05），與年齡、性別及腫瘤直徑無(wú)關(guān)（P 均＞0.05）。見(jiàn)表1。

2.4 血清中miR-663 與sHLA-G 對(duì)胃癌的診斷價(jià)值 ROC 曲線分析顯示，血清miR-663、sHLA-G 表達(dá)對(duì)胃癌有較高診斷價(jià)值，曲線下面積（AUC）分別為0.793、0.855，理論閾值分別為4.8、25 ng/mL，靈敏度分別為0.825、0.843，特異度分別為0.741、0.857，約登指數(shù)分別為0.566、0.690。兩者聯(lián)合應(yīng)用診斷效能提高，敏感度和特異度分別為0.878、0.860，約登指數(shù)為0.738。

表1 胃癌組血清miR-663、sHLA-G表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

3 討論

胃癌是全球性的惡性腫瘤，全世界每年新發(fā)胃癌患者約100萬(wàn)例，約7萬(wàn)例死亡［10］。近年胃癌發(fā)病率有所降低，但仍有部分患者被診斷為胃癌晚期，且80%的患者由于癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移而導(dǎo)致死亡［11］。胃癌的主要治療手段有手術(shù)切除、放療及化療或靶向治療。因早期胃癌臨床癥狀不明顯，易被忽略而耽誤病情。

miRNA 是一種單鏈非編碼RNA 分子，能對(duì)靶基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)進(jìn)行調(diào)控［12］。截至目前，在植物、動(dòng)物甚至病毒基因組中已發(fā)現(xiàn)數(shù)百種miRNA。miRNA通過(guò)與mRNA 序列的3'-非翻譯區(qū)（UTR）結(jié)合，進(jìn)而導(dǎo)致mRNA 降解或抑制其翻譯功能［13］。研究表明，miRNA 在腫瘤發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮重要作用，如促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移［12］。miR-663 是miRNA 家族的成員之一，在多種腫瘤疾病中均有異常表達(dá)，如甲狀腺癌、胰腺癌［14］，在胃癌中研究較少。據(jù)報(bào)道，低表達(dá)的miR-663 可通過(guò)抑制上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程從而對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)起抑制作用［14］。本研究結(jié)果表明，胃癌組血清中miR-663 相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且與胃癌的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明miR-663 參與胃癌病變的發(fā)生。可能是過(guò)表達(dá)的miR-663靶向下調(diào)TGF-β1表達(dá)進(jìn)而影響其翻譯功能，從而在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到抑制作用。當(dāng)miR-663 表達(dá)降低時(shí)，其對(duì)下游靶基因的抑制作用減弱，間接促進(jìn)其翻譯過(guò)程，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖分化，提高腫瘤的惡性程度及臨床分期［14］。本研究結(jié)果還顯示，miR-663 的相對(duì)表達(dá)量與細(xì)胞分化程度、TNM 分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。研究表明，miR-663 通過(guò)下調(diào)靶基因PUMA/BBC3 及BTG2 表達(dá)影響線粒體的外膜通透性，從而抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，加速癌細(xì)胞的凋亡，抑制腫瘤進(jìn)展。胃癌組血漿miR-663 表達(dá)降低，其抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)功能降低，癌細(xì)胞的凋亡數(shù)量減少，癌細(xì)胞的增殖、分化及侵襲轉(zhuǎn)移促進(jìn)，腫瘤惡性程度進(jìn)一步升高［15］。此外，低表達(dá)的miR-663 可靶向調(diào)節(jié)p21（WAF1/CIP1）表達(dá)，使p21 基因的腫瘤抑制作用減弱，并協(xié)調(diào)細(xì)胞的生長(zhǎng)周期、DNA 修復(fù)過(guò)程，促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖，加速腫瘤的惡性進(jìn)展。

HLA-G 是一種低多態(tài)性的分子（已鑒定出51個(gè)等位基因），由α 鏈非共價(jià)結(jié)合β2微球蛋白構(gòu)成［16］。HLA-G 主要在調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，其主要功能是通過(guò)與NK 細(xì)胞抑制受體（KIR2DL 或ILT-2）相互作用調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)［16］。研究顯示，卵巢癌組織中HLA-G 表達(dá)上調(diào)，在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮促進(jìn)作用［17］。sHLA-G 是一種可溶性的HLA-G分子，其在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制尚不清楚。本研究結(jié)果表明，胃癌組血清sHLA-G 水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且與胃癌的發(fā)生呈正相關(guān)。其機(jī)制可能是sHLA-G 異常升高，使得腫瘤細(xì)胞逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)視，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，減少凋亡細(xì)胞數(shù)量，加速腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移過(guò)程，從而加速腫瘤的惡性進(jìn)展［18］。本研究結(jié)果還顯示，sH?LA-G 水平與分化程度、TNM 分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。sHLA-G 可刺激PI3K/Akt/mTOP 信號(hào)通路，從而抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展［17，19］。此外，過(guò)高sHLA-G 可抑制免疫細(xì)胞T 細(xì)胞、NK 細(xì)胞的功能，為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)提供良好環(huán)境，使得機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫殺傷功能受抑，最終促進(jìn)胃癌的發(fā)生發(fā)展［20］。高水平的sHLA-G 能直接抑制自然殺傷細(xì)胞、T 細(xì)胞的功能，為胃癌的形成、發(fā)展及轉(zhuǎn)移創(chuàng)造免疫抑制微環(huán)境，從而妨礙機(jī)體對(duì)腫瘤免疫監(jiān)視并抑制機(jī)體抗腫瘤的免疫殺傷效應(yīng)，最終促進(jìn)胃癌的發(fā)生發(fā)展。此外，本研究ROC 曲線分析顯示，二者均能有效診斷胃癌，且聯(lián)合應(yīng)用診斷胃癌時(shí)，其診斷價(jià)值較單獨(dú)應(yīng)用時(shí)高。

綜上所述，胃癌患者血清中miR-663 表達(dá)降低、sHLA-G 水平升高，且與腫瘤TNM 分期、細(xì)胞分化程度、淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)，可作為胃癌診斷分子標(biāo)志物。但本研究為回顧性分析，樣本量較小，且未動(dòng)態(tài)檢測(cè)，確切結(jié)論需進(jìn)一步研究證實(shí)。