非小細(xì)胞肺癌組織中l(wèi)ncRNA UFC1、TRIM59的表達(dá)變化及意義

湯玲，包振麗，劉寧寧

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海200120

非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）是最常見(jiàn)的肺癌類型，主要起源于支氣管黏膜或肺組織［1］。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）是長(zhǎng)度超過(guò)200 nt 的亞類非編碼RNA，具有高度的細(xì)胞特異性和組織特異性，參與細(xì)胞存活、增殖及基因穩(wěn)定性等多種生命活動(dòng)的調(diào)控［2］。lncRNA UFC1 主要位于細(xì)胞質(zhì)中，在肝癌和胰腺癌中呈高表達(dá)［2-3］。三基序蛋白59（TRIM59）屬于TRIM 家族，其結(jié)構(gòu)上呈高度保守性，對(duì)信號(hào)傳遞、基因表達(dá)、炎癥免疫及損傷修復(fù)等過(guò)程起調(diào)控作用［4］。在胃癌組織中，TRIM59能促進(jìn)p53泛素化，且抑制p53 表達(dá)，從而誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)及侵襲［5］。已有研究表明，lncRNA UFC1 和TRIM59 在NSCLC中異常表達(dá)［6-7］，但兩者與NSCLC 患者臨床病理參數(shù)關(guān)系的研究尚少。本研究旨在探討NSCLC 組織中l(wèi)ncRNA UFC1和TRIM59的表達(dá)變化及意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取本院2017 年12 月－2020 年1月收治的82 例NSCLC 患者的病理及臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：①參照《CSCO 原發(fā)性肺癌診療指南2016》［8］中的相關(guān)規(guī)定進(jìn)行診斷，且均經(jīng)術(shù)后病理確診為NSCLC ；②確診前未行放化療或肺部手術(shù)；③所有患者自愿協(xié)助本研究，且病理和臨床資料齊全。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴有重度支氣管擴(kuò)張或慢性阻塞性肺病者；②伴發(fā)其他惡性腫瘤者；③心、肝及腎功能失代償者；④伴有重癥肺炎或嚴(yán)重惡病質(zhì)而不宜手術(shù)者；⑤伴有免疫系統(tǒng)缺陷者。其中男46 例、女36 例，年齡（56.19 ± 8.33）歲；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者9 例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移73 例；低分化5 例、中分化40 例、高分化37例；腫瘤直徑≤3 cm 38 例，腫瘤直徑＞3 cm 44 例；TNM 分期Ⅰ期32 例、Ⅱ期42 例、Ⅲ期6 例、Ⅳ期2例；鱗癌38 例、腺癌35 例、其他類型癌9 例。NSCLC患者均簽署知情同意書(shū)。本研究獲醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 lncRNA UFC1和TRIM59 mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR 技術(shù)。癌組織及其癌旁肺組織（距癌組織5 cm 處）均通過(guò)術(shù)中采集，經(jīng)液氮暫存后統(tǒng)一保存于-80 ℃冰箱中。每種樣本均采集30 mg，經(jīng)冰上均勻研磨處理后滴加1 mL TRIzol試劑（Invit?rogen 公司）提取總RNA。通過(guò)PrimeScriptTMRT Re?agent Kit 試劑盒（北京市諾博萊德科技公司）合成cDNA。通過(guò)SYBR Premix Ex TaqTM（TaKaRa 公司）檢 測(cè)lncRNA UFC1 和TRIM59 mRNA 表 達(dá)。ln?cRNA UFC1和TRIM59的反應(yīng)條件均為37 ℃15 min，85 ℃5 s。PCR 擴(kuò)增體系：2×SYBR Green 10 μL、sense primer 0.4 μL、antisense primer 0.4 μL 、dH2O 7.2 μL 及cDNA 2 μL，共計(jì)20 μL。lncRNA UFC1 正向引物5'-CCAACCTGAGTGACATAGCGA-3'、反向引物5′-CTGACCTCCAACTCCAACGAAT-3'，內(nèi)參基因β-actin 的正向引物5'-ACAGGGAAGACATCACT?GAGCC-3′、反向引物5'-CAGTGGGATGGTGGGTG?TAAGA-3'；TRIM59正向引物5'-CCTGTGTTTGAGA?TAGATTTAAGAGC-3'、反向引物5'-GCAACAAGGT?GAGACCCAGT-3'，內(nèi)參基因β-actin 正向引物5'-AAATCCCATCACCATCTTCC-3'、反向引物5'-TCA?CACCCATGACGAACA-3'。lncRNA UFC1和TRIM59的PCR反應(yīng)條件均為預(yù)變性95 ℃2 min、變性93 ℃1 min、退火55 ℃1 min、延伸72 ℃1 min，共擴(kuò)增40 個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣本3個(gè)復(fù)孔。所用引物序列由上海康成公 司 負(fù) 責(zé) 合 成。以2-ΔΔCt法 計(jì) 算lncRNA UFC1 和TRIM59的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 TRIM59蛋白表達(dá)檢測(cè)。采用免疫組化法。術(shù)中采集NSCLC癌組織及其癌旁肺組織（距癌組織5 cm處）由液氮暫存后置于-80 ℃冰箱中。由二甲苯脫蠟15 min 后進(jìn)行梯度乙醇水化5 min。抗原修復(fù)液浸泡脫蠟的玻片，在91～93 ℃條件下加熱3 min，室溫靜置5 min，最后在80～90 ℃條件下加熱24 min。將玻片置于3%H2O2溶液中使內(nèi)源性過(guò)氧化物酶失活，孵育5 min，共3 次。滴加適量的Blocking Solu?tion（中杉金橋公司）進(jìn)行封閉，孵育10 min。滴加3%稀釋的一抗工作液（美國(guó)Sigma 公司），保存于4 ℃條件下過(guò)夜。用PBS緩沖液清洗3次，每次3 min；然后滴加適量的生物素化通用二抗（中杉金橋公司），孵育15 min 后再用PBS 清洗3 次；最后滴加適量的辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液（中杉金橋公司），室溫孵育15 min。滴加適量的DAB 稀釋液（美國(guó)Invitrogen公司）進(jìn)行DAB染色。通過(guò)蘇木素溶液（中杉金橋公司）復(fù)染6 s，漂洗反藍(lán)后進(jìn)行脫水封片。根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞評(píng)分進(jìn)行半定量分析。染色強(qiáng)度：無(wú)細(xì)胞染色計(jì)0分，淺棕色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2 分，褐色計(jì)3 分。陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分：少于10%計(jì)0分，10%～≤25%計(jì)1分，＞25%～50%計(jì)2分，50%以上計(jì)3 分。兩項(xiàng)得分相加為總分，0～2 分為陰性表達(dá)，3～6分為陽(yáng)性表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較應(yīng)用方差分析，兩組間比較應(yīng)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。相關(guān)性檢驗(yàn)應(yīng)用Pearson相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC 組織及其對(duì)應(yīng)癌旁組織中l(wèi)ncRNA UFC1 和TRIM59 表達(dá)比較 NSCLC 組織及其對(duì)應(yīng)癌旁組織lncRNA UFC1 的相對(duì)表達(dá)量分別為7.16± 3.31、2.85 ± 1.19，而TRIM59 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量分別為6.49±1.96、3.42±1.03。NSCLC 組織中l(wèi)ncRNA UFC1 和TRIM59 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量較癌旁組織上升（P均＜0.05）。TRIM59蛋白在NSCLC組織、癌旁組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為65.85%（65/82）、15.85%（13/82），二者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=66.109，P＜0.05）。

2.2 NSCLC 組 織 中l(wèi)ncRNA UFC1 和TRIM59 mRNA表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 NSCLC組織中l(wèi)ncRNA UFC1 和TRIM59 mRNA 表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)（P均＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 NSCLC組織中l(wèi)ncRNA UFC1和TRIM59 mRNA表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 NSCLC 組 織 中l(wèi)ncRNA UFC1 和TRIM59 mRNA 表達(dá)的相關(guān)性 NSCLC 組織中l(wèi)ncRNA UFC1表達(dá)和TRIM59 mRNA 表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.726，P＜0.05）。

3 討論

肺癌每年新增病例和死亡病例分別為70 萬(wàn)例和60 萬(wàn)例，其中以NSCLC 最常見(jiàn)，約占總體的85%［9］。NSCLC 起病多與家族遺傳、易感基因、空氣污染及吸煙有關(guān)［1］。目前，手術(shù)聯(lián)合放化療是治療NSCLC 的主要手段，但由于NSCLC 確診時(shí)多處于進(jìn)展期，癌癥易于轉(zhuǎn)移，從而使術(shù)后的復(fù)發(fā)率較高、預(yù)后生存率降低。近年來(lái)，基因組學(xué)和分子生物學(xué)是腫瘤領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，人們發(fā)現(xiàn)DNA 甲基化、非編碼RNA、lncRNA、外泌體及組蛋白修飾等過(guò)程在腫瘤的起病和進(jìn)展中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，阻遏或誘導(dǎo)原癌基因的表達(dá)，參與調(diào)控細(xì)胞分裂、分化及凋亡等生命活動(dòng)，使腫瘤微環(huán)境發(fā)生改變，從而影響腫瘤演變的進(jìn)程［10-11］。

lncRNA屬于內(nèi)源性非編碼RNA，參與調(diào)節(jié)基因表達(dá)、DNA 損傷修復(fù)及轉(zhuǎn)錄后加工等過(guò)程。lncRNA序列、空間結(jié)構(gòu)與蛋白結(jié)合及表達(dá)量的異常均能影響下游靶基因的基因表達(dá)，與腫瘤和炎癥的發(fā)生密切相關(guān)。研究［13］表明，lncRNA-UFC1 能激活轉(zhuǎn)錄因子E2F1，從而抑制癌細(xì)胞凋亡，使癌細(xì)胞的侵襲性增強(qiáng)。本研究結(jié)果顯示，NSCLC 組織中l(wèi)ncRNA UFC1的表達(dá)量較癌旁組織上升，表明lncRNA UFC1參與NSCLC 的發(fā)病過(guò)程。NSCLC 組織中癌細(xì)胞具有無(wú)限增殖的能力，而高表達(dá)的lncRNA UFC1 能通過(guò)端粒酶不斷修復(fù)受損端粒，避免癌細(xì)胞凋亡，使其能無(wú)限分裂［6］。同時(shí)，NSCLC 組織內(nèi)的原癌基因cmyc 上調(diào)，通過(guò)正反饋?zhàn)饔谜T導(dǎo)lncRNA UFC1表達(dá)，但具體調(diào)控機(jī)制尚不清楚，仍需進(jìn)一步研究［2］。同時(shí)。本研究結(jié)果顯示，NSCLC 組織中l(wèi)ncRNA UFC1的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM 分期有關(guān)，表明ln?cRNA UFC1 參與NSCLC 的進(jìn)展。其機(jī)制可能為ln?cRNA UFC1 上調(diào)后誘導(dǎo)癌細(xì)胞由G0期轉(zhuǎn)化為S 期，且使癌細(xì)胞凋亡受阻，縮短細(xì)胞分裂周期，從而促進(jìn)癌細(xì)胞的分裂及增殖［3］。此外，高表達(dá)的lncRNA UFC1 能誘導(dǎo)β-catenin 表達(dá)，其通過(guò)促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化影響細(xì)胞外基質(zhì)重塑，從而增強(qiáng)癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力［2］。

TRIM 家族是高度保守的蛋白超家族，由3 個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，包含70多個(gè)成員，能調(diào)節(jié)泛素化酶活性、鋅離子結(jié)合及介導(dǎo)自身同源寡聚等過(guò)程［13］。TRIM59 是一種表面分子，屬于超家族的C-XI 亞家族，位于第3 號(hào)染色體，主要存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，共包含403 個(gè)氨基酸殘基［4］。TRIM59 在肝癌、乳腺癌及胃癌中呈明顯高表達(dá)，可能起到原癌基因的作用［4-5，14］。研究［15］表明，敲除TRIM59 后，抗凋亡蛋白Bax 活性降低，而促凋亡蛋白Bcl-2 活性增強(qiáng)，腫瘤細(xì)胞增殖速度明顯降低。本研究結(jié)果顯示，NSCLC組織中TRIM59 mRNA 及蛋白表達(dá)均較癌旁組織上升，表明TRIM59 參與NSCLC 的發(fā)病過(guò)程。其原因可能為癌細(xì)胞代謝旺盛，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)活性增強(qiáng)，合成和分泌的蛋白質(zhì)增多，而TRIM59 主要存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜中，導(dǎo)致TRIM59 表達(dá)上調(diào)［14］。本研究結(jié)果顯示，NSCLC 組織中TRIM59 的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)。其原因可能為T(mén)RIM59 上調(diào)后能夠使癌細(xì)胞在G2/M 期的比例增加，同時(shí)增強(qiáng)CyclinB1 和CDC2 細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白的活性，提高細(xì)胞分裂的頻率及縮短細(xì)胞分裂的時(shí)間，從而促進(jìn)癌細(xì)胞快速增殖、分化［16］。此外，高表達(dá)的TRIM59 能阻遏E-鈣粘蛋白且誘導(dǎo)波形蛋白表達(dá)，從而降低癌細(xì)胞間的黏附強(qiáng)度，使其易于穿透基底膜侵襲周圍組織或器官［4］。

NSCLC 組織中l(wèi)ncRNA UFC1 表達(dá)和TRIM59 表達(dá)呈正相關(guān)，提示TRIM59 可能是lncRNA UFC1 的下游靶點(diǎn)，lncRNA UFC1 可能通過(guò)調(diào)節(jié)TRIM59 的活性影響NSCLC進(jìn)展。

綜 上 所 述，NSCLC 組 織 中l(wèi)ncRNA UFC1 和TRIM59 的表達(dá)均增加，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM 分期密切相關(guān)，對(duì)判斷病情進(jìn)展具有重要價(jià)值。