血漿miR-127、IL-32 水平對急性肺損傷患者預后的預測價值

張永軍，呂會禮，廖玉峰，劉俊宏，譚勇平，文軍

郴州市第一人民醫院，湖南郴州423000

急性肺損傷（ALI）是由非心源性因素損傷肺毛細血管內皮細胞和肺泡上皮細胞，導致的彌漫性肺間質和肺泡水腫，其起病急、進展快，若不及時給予有效治療，可發展為急性呼吸窘迫綜合癥［1］。目前臨床主要通過臨床體征、癥狀、結合病史判斷，ALI診斷及預后預測尚缺乏特定生物標志物。近年研究表明［2-3］，炎癥反應在ALI發生發展中發揮重要作用。微小RNA（miRNA）是一類新型的基因調控分子，參與調控細胞多種生物學功能。研究［4］發現，miR-127可通過影響靶基因表達進而調控免疫和炎癥反應，參與肺部炎癥反應。白細胞介素-32（IL-32）是近年來新發現的一種白細胞介素，能誘導多種炎性細胞因子和巨噬細胞炎性蛋白2 表達，與多種炎癥性疾病有密切關系［5］。本研究檢測ALI 患者血漿miR-127、IL-32水平，探討其意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取我院2019 年1 月—2020 年6月收治的233 例ALI 患者為觀察組，均表現為不同程度通氣/血液比例失調、肺容量減少、肺順應性下降，根據患者死亡或痊愈出院分為兩組，死亡組87例，其 中 男58 例，女29 例；年齡46～78（58.93 ±5.57）歲；BMI 19～27（23.16 ± 2.38）kg/m2；病因：胰腺炎5 例，創傷24 例，感染56 例，其他2 例；冠心病史10 例，高血壓史27 例，糖尿病史13 例。存活組146 例，其中男92 例，女54 例；年齡44～76（57.25 ±5.26）歲；BMI 19～27（23.51 ± 2.29）kg/m2。病因：胰腺炎10 例，創傷31 例，感染98 例，其他7 例；冠心病史11 例，高血壓史35 例，糖尿病史26 例。納入標準：①經臨床體征、癥狀、結合病史確診；②符合《急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征診斷和治療指南（2006）》［6］中ALI 診斷標準；③臨床資料完整；④患者及家屬均知情同意；⑤無精神疾病；排除標準：①支氣管哮喘；②肺結核；③自身免疫性疾病者；④惡性腫瘤。另選取58 例體檢健康者為對照組，其中男37 例，女21 例；年齡43～76（57.52 ± 9.67）歲；BMI 19～27（23.20± 2.17）kg/m2。三組性別、年齡、BMI、病因、既往史比較差異無統計學意義（P 均＞0.05）。本研究經醫院倫理委員會批準。

1.2 血漿miR-127、IL-32水平測定 抽取觀察組入院當天和對照組體檢日空腹靜脈血3 mL，EDTA-K2抗凝，3 000 r/min 離心8 min，離心半徑8 cm，分離血漿，置于-80 ℃環境中保存，TRIzol 總RNA 抽提試劑（上海碧云天生物技術有限公司，產品編號：R0016，規格：100 mL）提取血漿總RNA，加入反應液，TaKa?Ra 反轉錄試劑盒（北京田根生化科技有限公司，產品編號：FP314，規格：50 μL）轉錄合成cDNA，加入miR-127 正 向 引 物：5′-GCGGCTCGGATCCGTCT?GAGCT-3'，反向引物5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'；RT-PCR 擴增，條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火60 s，72 ℃延伸30 s，循環45 次，各管設置3 個復孔，以U6 做內參校正，正向引物5'-CTC?GCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物5'-AACGCTTCAC?GAATTTGCG-3'，反應結束后得到各反應管Ct，2-ΔΔCt法計算血漿miR-127 相對表達量。酶聯免疫吸附法測定血漿IL-32 水平，所有操作嚴格按照試劑盒（上海赫澎生物科技有公司，規格：48T/96T）說明書進行。

1.3 觀察指標 收集ALI 患者一般資料，包括性別、年齡、BMI、病因、病史、心率（HR）、呼吸頻率、魚躍YE660A 型血壓測量儀測定收縮壓（SBP）和舒張壓（DBP）、超聲心動圖（邁瑞DCN2S 型彩色多普勒超聲診斷儀）測定平均動脈壓（MAP）、西門子EPOC型血氣分析儀測定呼氣末正壓（PEEP）、動脈血氧分壓（PaO2）、動脈血二氧化碳分壓（PaCO2）。

1.4 統計學方法 采用SPSS26.0 統計軟件。計量資料以±s表示，組間比較采用t 檢驗；計數資料比較采用χ2檢驗；采用多因素Logistic 回歸分析ALI 患者死亡危險因素；采用受試者工作特征（ROC）曲線判斷血漿miR-127、IL-32 水平對ALI 患者死亡的預測價值。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 觀察組與對照組血漿miR-127、IL-32 水平比較 觀察組血漿miR-127、IL-32 水平分別為1.42 ±0.93、（95.89 ± 22.54）ng/L，對照組血漿miR-127、IL-32水平分別為0.53±0.36、（52.15±18.72）ng/L，觀察組血漿miR-127、IL-32 水平高于對照組（t 分別為7.148、13.648，P均＜0.05）。

2.2 存活組和死亡組臨床資料對比 死亡組與存活組血漿miR-127 水平分別為2.42 ± 0.71、0.82 ±0.37，IL-32 水平分別為（115.91±19.06）、（83.96±14.62）ng/L，死亡組MAP 低于存活組，PEEP 和血漿miR-127、IL-32 水平高于存活組（P 均＜0.05），見表1。

2.3 ALI患者死亡危險因素的多因素Logistics回歸分析 以MAP（≥73.20 mmHg=2，＜73.20 mmHg=1）、PEEP（≥9.76 cmH2O=2，＜9.76 cmH2O=1）、miR-127、IL-32 為自變量，ALI 患者生存狀態為因變量（死亡=1，存活=0），多因素Logistic回歸分析顯示，高水平miR-127 和IL-32 為ALI 患者死亡的獨立危險因素（P均＜0.05）。見表2。

表1 存活組和死亡組臨床資料情況（ ± s）

表1 存活組和死亡組臨床資料情況（ ± s）

組別死亡組存活組n 87 146 t P HR（次/min）107.61±17.85 105.41±16.21 0.965＞0.05呼吸頻率（次/min）26.13±5.36 25.47±5.11 0.936＞0.05 SBP（mmHg）131.41±14.69 128.61±13.41 1.487＞0.05 DBP（mmHg）80.71±9.73 78.51±9.46 1.699＞0.05 MAP（mmHg）62.41±13.76 83.73±17.21 9.831＜0.05 PEEP（cmH2O）12.93±2.71 8.46±2.27 13.509＜0.05 PaO2（mmHg）60.21±14.16 61.51±14.38 0.671＞0.05 PaCO2（mmHg）39.16±7.51 37.29±7.31 1.87＞0.05

表2 ALI患者死亡危險因素的多因素Logistic回歸分析

2.4 血漿miR-127、IL-32 水平對ALI 患者死亡的預測價值 ROC 曲線分析顯示，血漿miR-127+IL-32 水平預測ALI 患者死亡的AUC 明顯大于miR-127、IL-32 單獨預測（Z 分別為3.909、3.743，P 均＜0.05），靈敏度、特異度、準確度均高于各指標單獨預測。見表3。

表3 血漿miR-127、IL-32水平對ALI患者死亡的預測價值

3 討論

ALI 是臨床常見急危重癥，當嚴重肺損傷得不到及時有效控制時，可加重肺組織水腫，進一步損害肺功能，最終發展為急性呼吸窘迫綜合癥，總體病死率高達35%～50%［7］。目前臨床尚缺乏ALI有效治療方式，病死率極高，故如何早期預測患者病情嚴重程度和預后，對改善患者預后有重要意義。目前研究一致認為，肺內難以控制的炎癥反應是ALI 發生重要原因，其機制可能是促炎因子誘導中性粒細胞遷移至肺泡腔，釋放大量炎癥遞質代謝產物，并誘導多種炎癥細胞聚集和釋放，形成正反饋效應，加重肺毛細血管內皮細胞和肺泡上皮細胞損傷，導致ALI 發生，并促進其發展為急性呼吸窘迫綜合癥［8］。

miRNA 是一組長約22 個核苷酸的非編碼RNA，可通過序列特異性堿基互補配對結合其靶miRNA 的3′-UTR，抑制靶miRNA 翻譯在轉錄后水平調控基因表達，參與調節細胞增殖、分化、遷移、凋亡、自噬等多種生物學功能［9］。隨著研究的進展，如今miRNA 已被廣泛用于腫瘤和心血管疾病的診斷中。miR-127 位于人類基因染色體14q32.2，所屬基因簇進化高度保守，具有抑制細胞增殖和促進細胞凋亡的作用［10］。2009 年BHASKARAN 等［11］研究發現，胎兒肺器官培養中過表達miR-127 能明顯降低末期芽數，增加內芽和末期芽大小，導致肺部發育不當，故推測miR-127 在肺部發育中發揮重要作用。研究發現，肺損傷期間患者血漿miR-127 表達明顯降低，通過體內肺損傷模型實驗發現，過表達miR-127 會導致肺通透性降低，增加細胞因子和炎性細胞浸潤，提示miR-127 與肺損傷有關［12］。為進一步探討miR-127 與肺損傷的關系，ESSANDOH 等［13］研究發現，過表達miR-127 能促進M1 巨噬細胞和促炎細胞因子生成，并抑制抗炎因子表達，引起不可控炎癥反應，參與肺部損傷。但LI 等［14］通過脂多糖處理巨噬細胞卻發現，miR-127 能通過靶向免疫球蛋白G-Fc 片段受體Ⅰ緩解肺部炎癥反應。同時CHUNG等［15］研究顯示，miR-127 可促進信號傳導與轉錄激活因子3磷酸化，參與細菌感染調控，增強宿主對細菌的清除能力，故認為miR-127 既可促進炎癥反應，亦可調控宿主免疫。本研究結果顯示，觀察組血漿miR-127 水平高于對照組，說明ALI 患者血漿miR-127水平明顯提升；死亡組血漿miR-127水平高于存活組，為ALI 患者死亡的獨立危險因素，說明miR-127與ALI患者預后密切相關，隨著其水平提升，ALI患者預后越差，其機制是過表達miR-127 激活c-Jun氨基末端激酶通路，調節巨噬細胞極化，促進肺部炎癥和損傷［16］。同時過表達miR-127 還能激活p38 絲裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）和核因子-κB（NFκB），增加肺通透性和肺中性粒細胞浸潤，誘導肺組織病理改變，促進ALI進展［17］。

IL-32 位于人類染色體16p13.3，由8 個編碼區組成，具備多種前炎癥細胞因子特性，可誘導巨噬細胞分泌腫瘤壞死因子-α（TNF-α），廣泛分布于大腦、睪丸、卵巢、前列腺、結腸、小腸、胸腺、脾臟、胰腺等組織器官，由上皮細胞、單核細胞、NK 細胞、T 細胞等內源性細胞分泌，在機體內的作用主要體現在免疫調節和炎癥反應兩個方面［18］。DAMEN 等［19］研究發現，類風濕性關節炎患者病理組織中IL-32表達明顯提升，可增強疾病炎癥加劇損傷，與患者病情嚴重程度密切相關。但在皰疹性口炎病毒、單純皰疹病毒、人類免疫缺陷病毒、甲型流感病毒等免疫性疾病中，IL-32 具有抗病毒和增強抗炎等作用［20］。RONG等［21］研究顯示，慢性阻塞性肺疾病患者肺組織內IL-32 表達明顯升高，可誘導并加速疾病發生發展。馬莉等［22］研究發現，大鼠ALI后肺組織中IL-32 濃度明顯升高，參與ALI的炎癥反應。本研究結果顯示，觀察組血漿IL-32水平高于對照組，說明ALI患者血漿IL-32 水平升高；死亡組血漿IL-32 水平明顯高于存活組，為ALI 患者死亡的獨立危險因素，說明IL-32與ALI患者預后密切相關，隨著其水平升高，IL-32患者預后越差，機制是過表達IL-32能激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1、p38 MAPK 和NF-κB 依賴途徑，誘導TNF-α、巨噬細胞炎癥蛋白2、IL-1β、IL-6、IL-8等趨化因子和細胞因子產生，參與ALI炎癥反應發展過程［23］。ROC 曲線結果顯示，血漿miR-127+IL-32水平預測ALI患者死亡的AUC、靈敏度、特異度、準確度高于各指標單獨預測，說明聯合檢測血漿miR-127、IL-32水平能提升ALI患者預后診斷價值。

綜上所述，ALI 患者血漿miR-127、IL-32 水平升高，與預后不良密切相關，聯合測定血漿miR-127、IL-32水平能提升對ALI患者預后的預測價值。